Оригинальное исследование Экспериментальные подходы к таргетному редактированию гена CFTR с помощью CRISPR-Cas9
С. А. Смирнихина, А. А. Анучина, К. С. Кочергин-Никитский, Э. П. Адильгереева, В. Д. Якушина, А. В. Лавров
Муковисцидоз — тяжелое аутосомно-рецессивное заболевание, обусловленное мутациями в гене CFTR, основной из которых в европейской популяции является F508del. Патогенетическая терапия существенно улучшила прогноз для жизни у пациентов с муковисцидозом, однако генная терапия не оказалась такой эффективной, как ожидалось. Геномное редактирование, в том числе с помощью CRISPR-Cas9, открывает новые возможности для этиотропного лечения, так как позволяет исправить мутации в клетках. Целью исследования было сравнение эффективности коррекции мутации F508del с помощью различных комбинаций направляющих РНК и Cas9 и повышение эффективности редактирования. Работу проводили на культуре клеток HEK293T, эффективность редактирования генома оценивали с помощью анализа T7E1, как на геномном, так и на плазмидном сайтах. Наиболее эффективной оказалась комбинация SaCas9 вместе с РНК на мутацию F508del — произошло редактирование 29% аллелей. Комбинация аналогичной направляющей РНК на F508del для SpCas9 показала небольшую эффективность редактирования, что связано с низкой экспрессией направляющей РНК. Были предприняты попытки увеличения экспрессии данной РНК с помощью разных подходов, однако повышения эффективности ее работы получено не было. Стабилизация направляющей РНК путем добавления в последовательность G-квадруплекса, укорочения и добавления GG в 5′-область также не принесла результатов. Вероятно, низкая эффективность работы использованной направляющей РНК обусловлена ее нуклеотидной последовательностью, что ограничивает ее использование.
Статья получена: 15.03.2018
Опубликовано online: 04.07.2018
DOI: 10.24075/vrgmu.2018.022
Комментарии 0
ПРОСМОТРЫ 7958
Оригинальное исследование Cas13a: получение и использование для определения вирусной РНК
А. С. Савинова, Е. Ю. Коптев, Е. В. Усачев, А. П. Ткачук, В. А. Гущин
Использование CRISPR-Cas систем для редактирования геномов организмов в последнее время стало одним из магистральных научных направлений. Между тем белки системы CAS можно применять для разработки методов молекулярной диагностики. Традиционные подходы к идентификации микроорганизмов имеют ряд недостатков: они времязатратны (культуральные методы диагностики), недостаточно чувствительны (иммунологические методы), имеют высокую себестоимость и методически сложны (ПЦР, секвенирование). Целью работы было получение функционально активного препарата белка Cas13а и изучение его поведения в различных условиях, в том числе при изменении концентрации мишени, для дальнейшего использования в диагностических целях. Была создана генетическая экспрессионная конструкция, имеющая на 5'-конце T7-промотер и ген сas13a бактерии <i>Leptotrichia wadei</i>. Получены препараты функционально активной программируемой РНКазы белка Cas13a, направляющей РНК, а также РНК вируса гриппа Б (РНК-мишень). Функциональную активность РНКазы белка Cas13a определяли по появлению флуоресцентного сигнала в реакционной смеси, содержащей направляющую РНК, РНК-мишень, молекулярный РНК-маячок. Показано, что полученный препарат белка Cas13a способен специфически выявлять мишень на примере фрагментов РНК вируса гриппа Б и не обладает неспецифическими видами РНКазной активности. Данное исследование может стать основой для создания нового быстрого специфичного и чувствительного метода идентификации микроорганизмов.
Статья получена: 31.05.2018
Опубликовано online: 01.07.2018
DOI: 10.24075/vrgmu.2018.021
Комментарии 0
ПРОСМОТРЫ 8182
Метод Алгоритм хирургического лечения больных с рассекающим остеохондритом коленного сустава
К. А. Егиазарян, Г. Д. Лазишвили, И. В. Храменкова, М. А. Шпак, Д. А. Бадриев
Наиболее часто рассекающий остеохондрит коленного сустава, или болезнь Кёнига, встречается у активных молодых людей, занятых физическим трудом, спортом, т. е. представителей социально активной прослойки населения. Несмотря на разнообразие современных методик хирургического лечения болезни, остается много спорных вопросов по их применению, отсутствует оптимальный подход и ограничена доступность качественных биоматериалов, требующихся при вмешательстве. Проведенный анализ результатов лечения пациентов за несколько лет показал высокую актуальность и необходимость решения многих вопросов этой проблемы. В работе представлен алгоритм хирургического лечения рассекающего остеохондрита коленного сустава. Обоснованы показания к оперативному вмешательству, предложены оптимальные способы коррекции локальных дефектов хряща в зависимости от стадии его поражения и возраста пациента, даны рекомендации, основанные на практическом опыте авторов.
Статья получена: 16.05.2018
Опубликовано online: 27.06.2018
DOI: 10.24075/vrgmu.2018.020
Комментарии 0
ПРОСМОТРЫ 9160
Оригинальное исследование Поиск и анализ CRISPR-Cas системы в штамме Escherichia coli HS и детектируемых спейсерами его CRISPR-кассеты фаговых рас методами биоинформатики
Е. И. Иванова, Ю. П. Джиоев, А. Ю. Борисенко, Н. П. Перетолчина, Л. А. Степаненко, Е. В. Григорова, А. И. Парамонов, У. М. Немченко, Т. В. Туник, Е. А. Кунгурцева
CRISPR-Cas система — это иммунная система прокариот, обеспечивающая защиту от чужеродных репликонов, в первую очередь вирусов и плазмид. Устойчивость к повторным инфекциям приобретается в результате включения в состав CRISPR-кассет коротких последовательностей, или спейсеров, комплементарных участкам соответствующих вирусных или плазмидных геномов. В настоящее время эшерихиозные инфекции остаются серьезной проблемой практической медицины. Вследствие их крайней устойчивости к терапии с использованием антибиотиков необходима разработка новых подходов лечения. Целью исследования был поиск структур CRISPR-Cas систем в геномной последовательности штамма Escherichia coli HS. Использовали методы программного моделирования MacSyFinder (Macromolecular System Finder, ver. 1.0.2.). Поиск точной гомологии последовательностей осуществляли посредством установленных вспомогательных пакетов makeblastdb (ver. 2.2.28), HMMER (ver. 3.0). В результате методами биоинформатики была выявлена одна CRISPR-Cas система и расшифрованы спейсерные последовательности CRISPR-кассеты у штамма Escherichia coli HS. С помощью последовательностей спейсеров CRISPR-кассеты были определены комплементарные им протоспейсерные участки нескольких типов фагов, что позволяет оценить степень их устойчивости к этим чужеродным генетическим элементам.
Статья получена: 15.03.2018
Опубликовано online: 27.06.2018
DOI: 10.24075/vrgmu.2018.019
Комментарии 0
ПРОСМОТРЫ 7453
Оригинальное исследование Низкотемпературная атмосферная плазма в коррекции возрастных изменений кожи лица
М. И. Шемшук, В. Н. Короткий, Д. Н. Серов, М. А. Кочетков, А. Г. Стенько, Н. Г. Короткий
В антивозрастной терапии кожи лица стандартно используют ультрафиолетовое облучение, обработку поверхности кожи озоном и оксидом азота и воздействие электромагнитным полем. Низкотемпературная атмосферная плазма (НТП) способна оказать все эти воздействия. Целью работы было оценить эффективность НТП низкой интенсивности в качестве антивозрастной терапии кожи лица. Десяти пациенткам в возрасте 50–55 лет проводили исследование состояния кожи лица (Т-зону (центр лба), области «гусиных лапок» справа и слева) на аппарате DUB SkinScaner до начала применения НТП и через сутки после 10 процедур. После очищения кожи ее обработали НТП низкой интенсивности, которую генерировали в среде гелия в виде плазменного факела на приборе «ГЕЛИОС» («НПЦ Плазма», Россия). Время экспозиции НТП составило 5 мин на каждую зону, процедуры проводили через день. До лечения состояние кожи лица всех участниц соответствовало третьему морфотипу инволюционных изменений. Ультразвуковое исследование (УЗИ) всех зон показало значительную деформацию микрорельефа, утолщение эпидермиса при сохранении четкой границы эпидермиса и дермы, некоторое снижение толщины дермы с однородной эхоструктурой, смазанное отграничение дермы от гиподермы. После завершения курса у всех пациенток отмечено уменьшение деформации микрорельефа, средней толщины эпидермиса и ультразвуковой плотности эпидермиса и дермы, тенденция к увеличению средней толщины дермы. Наибольшие изменения коснулись морщин: наблюдалось их сглаживание в области «гусиных лапок». Таким образом, использоване НТП вызвало уменьшение толщины рогового слоя эпидермиса, улучшение микроциркуляции и улучшение качества гидролипидной мантии кожи, что сопровождалось сглаживанием морщин. Нежелательных явлений со стороны кожного покрова и придатков кожи не было отмечено.
Статья получена: 15.03.2018
Опубликовано online: 22.06.2018
DOI: 10.24075/vrgmu.2018.018
Комментарии 0
ПРОСМОТРЫ 9032
Оригинальное исследование Клинико-рентгенологическая характеристика пациентов с цервикальным синдромом после травмы надплечья
Е. Б. Калинский , А. В. Черняев, Л. Ю. Слиняков, А. В. Лычагин, Б. М. Калинский, Ю. Р. Гончарук
Cостояние шейного отдела позвоночника (ШОП) находится во взаимосвязи с функциональным состоянием пояса верхней конечности. Повреждения пояса верхней конечности могут лежать в основе болевых ощущений в ШОП, в том числе вызывать цервикалгию. Целью исследования было оценить клинико-рентгенологическую картину ШОП у пациентов с цервикалгией, перенесших травму плечевого пояса. В исследование вошли 400 пациентов с жалобами на цервикалгию. Интенсивность боли оценивали по визуально-аналоговой шкале (VAS), ограничения жизнедеятельности — по опроснику NDI-RU (The Neck Disability Index, Russian language). При осмотре пациентов проводили оценку профиля позвоночника и локальных изменений в ШОП. Всем лицам, включенным в исследование, было выполнено рентгенологическое обследование ШОП в боковой и передне-задней проекциях, у 49,5% пациентов проведена постуральная цифровая рентгенография позвоночника для оценки сагиттального профиля ШОП. Всем пациентам была сделана магнитно-резонансная томография (МРТ). По результатам комплексного клинико-лучевого обследования у пациентов были отмечены функциональные изменения, которые можно трактовать как причину развития цервикалгии. С точки зрения структурно-функционального диагноза определены различные статико- динамические нарушения. Таким образом, было выявлено, что болевой синдром в области ШОП является часто встречающейся проблемой у пациентов, перенесших травму надплечья.
Статья получена: 15.03.2018
Опубликовано online: 16.06.2018
DOI: 10.24075/vrgmu.2018.017
Комментарии 0
ПРОСМОТРЫ 7636
Обзор CRISPR-Cas системы Mусоbacterium tuberculosis: структура модуля, изменение в процессе эволюции у различных линий, возможная роль в формировании вирулентности и лекарственной устойчивости
М. В. Зайчикова, Н. В. Захаревич, М. С. Чекалина, В. Н. Даниленко
CRISPR-Сas системы широко распространены у бактерий и архей. Они обеспечивают адаптивный иммунитет к бактериофагам и плазмидам, а также выполняют другие функции, включая регуляцию экспрессии генов, репарацию ДНК, формирование вирулентности. Нами был проведен анализ CRISPR-Сas систем полностью секвенированных геномов Mусоbacterium tuberculosis из семи линий: Beijing, B0/W-148, EAI, Haarlem, Ural, LAM, S. Проанализированные геномы содержат CRISPR-Сas систему типа III-A. Линиям в составе вида M. tuberculosis свойственны различия в строении CRISPR-Сas системы, в том числе редукция части системы у линии Beijing. Для cas-генов нами был осуществлен поиск возможных функциональных партнеров и компенсаторных механизмов с использованием метода филогенетического профайлинга. В ходе анализа филогенетических профилей (ФП) были обнаружены гены со сходным характером эволюционных событий. Установлено, что потеря части системы CRISPR-Cas у представителей линии Beijing сопровождалась по крайней мере двумя эволюционными событиями потери и одним событием приобретения участков генома. Возможность изучения альтернативных функций CRISPR-Сas систем у M. tuberculosis и их предполагаемая связь с другими генными системами представляет значительный интерес.
Статья получена: 15.03.2018
Опубликовано online: 08.06.2018
DOI: 10.24075/vrgmu.2018.016
Комментарии 0
ПРОСМОТРЫ 8457
Метод Гемодинамика матки и состояние овариального резерва в оценке эффективности экстракорпорального оплодотворения
А. К. Рабаданова, Р. И. Шалина, Н. А. Гугушвили
Эффективность программы экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) зависит от ряда факторов, среди которых большое значение имеют эмбриональный и эндометриальный. Каждый из этих факторов напрямую зависит от овариального резерва, определяющего качество ооцитов и изменение допплерометрических показателей в матке, которые отражают снижение внутриматочной перфузии. Целью исследования было прогнозирование эффективности циклов ЭКО и переноса эмбрионов (ПЭ) у пациенток c различным овариальным резервом на основании определения объемного кровотока в матке в день переноса эмбриона с помощью 3D-УЗИ с функцией энергетической допплерографии. У 56 пациенток с различным овариальным резервом произведено измерение параметров кровотока с помощью 3D-УЗИ и прикладной программы VOCAL (Virtual Organ Computer-aided AnaLysis) в матке, субэндометриальной зоне и в эндометрии в день переноса эмбриона с последующей оценкой эффективности циклов ЭКО. В ходе работы установлена зависимость между параметрами 3D-кровотока в матке и субэндометриальной зоне и эффективностью циклов ЭКО и ПЭ. При исследовании кровотока в эндометрии такая зависимость не выявлена. Таким образом, использование 3D-УЗИ с функцией энергетической допплерографии в день переноса эмбриона позволяет судить о степени выраженности рецептивности эндометрия и может быть использовано в качестве прогностического критерия для определения вероятности наступления беременности в цикле ЭКО.
Статья получена: 18.03.2018
Опубликовано online: 01.06.2018
DOI: 10.24075/vrgmu.2018.015
Комментарии 0
ПРОСМОТРЫ 9824