Колоректальный рак (КРР) — одна из ведущих форм злокачественных новообразований среди онкологических заболеваний и причин смертности в России [1] и в мире [2, 3]. Число больных с первичным КРР постоянно растет, причем заболеваемость гораздо выше в индустриально развитых странах Европы и Северной Америки, чем в развивающихся странах Африки, Азии и Южной Америки [2]. Развитие КРР тесно связано с механизмами регуляции иммунного ответа и сопровождается инфильтрацией опухоли иммунокомпетентными клетками [3–5]. Активно обсуждается роль хронического воспаления как фактора, способствующего развитию КРР, так как у больных с воспалительными заболеваниями кишечника увеличен риск возникновения КРР. По некоторым данным, противовоспалительная терапия снижает вероятность развития опухолей желудочно-кишечного тракта [7, 8].

В настоящее время в онкоиммунологии уделяется значительное внимание изучению эктонуклеозидтрифосфат-дифосфогидролазы-1 (ENTPD1, CD39). Молекула CD39 совместно с CD73 (экто-5′-нуклеотидаза, NТ5E) участвует в генерации внеклеточного аденозина. Образование внеклеточных пуриновых нуклеозидов играет фундаментальную роль в регуляции воспаления и тканевого гомеостаза. В иммунокомпетентных клетках аденозин передает сигнал преимущественно через рецептор A2A (A2АR), один из четырех аденозиновых рецепторов, связанных с G-белком. Стимуляция A2АR лимфоцитов приводит к уменьшению секреции IL2 и пролиферативной активности нативных CD4⁺ Т-клеток; снижению уровня IFNγ и IL4 у Т-хелперов; увеличению экспрессии молекул CTLA-4, PD1 и CD40L [8]. Иммуносупрессорный механизм, включающий взаимодействие аденозина и A2АR, способен защищать нормальные ткани от повреждений при развитии воспалительных реакций. Однако этот сигнальный путь активируется и в опухолевой ткани, особенно в ответ на гипоксию, что обеспечивает защиту раковых клеток от распознавания иммунной системой и уничтожения [9]. Роль данного механизма в развитии опухолей была продемонстрирована на экспериментальных моделях А2АR^–/–-мышей, у которых наблюдалась регрессия иммуногенных опухолей [10], а также мышей с нокаутом генов CD39 или CD73, отличающихся опухоль-резистентными свойствами [11, 12].

Экспрессия CD73 в опухолевой ткани описана довольно хорошо. Известно, что данный маркер экспрессируют различные типы клеток: опухолевые клетки, эндотелиальные клетки, клетки стромы [13]. Меньше известно об экспрессии в опухолевом микроокружении мембранного маркера СD39. Предполагается, что один из основных источников этой молекулы в инфильтрате опухоли — регуляторные Т-клетки (T_reg) [14]. Используя различные супрессорные механизмы, T_reg-клетки способны предотвращать развитие аутоиммунных реакций и поддерживать иммунологическую толерантность [15, 16]. Ключевым транскрипционным фактором этих клеток является FOXP3, который отвечает за их развитие и супрессорную функцию [17]. При канцерогенезе T_reg -клетки играют негативную роль, способствуя развитию опухоли. Показано, что они присутствуют в большом количестве в периферической крови онкологических больных и ткани различных форм опухолей [18].

На сегодняшний день КРР — один из наиболее распространенных типов злокачественных новообразований, однако роль аденозин-A2AR иммуносупрессорного механизма в его развитии до конца не изучена. Поэтому целью работы было исследование роли СD4⁺ Т-клеток, экспрессирующих CD39, в формировании иммунной супрессии у больных КРР.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

В работе обследовано 42 пациента с КРР, средний возраст которых составил 65 ± 12,4 лет. Критериями включения в исследование были: возраст 18–70 лет, наличие гистологически и цитологически подтвержденного диагноза «колоректальный рак». Критерии исключения: наличие других форм новообразований в анамнезе, а также иммуновоспалительных заболеваний. В качестве контроля анализировали лимфоциты 30 здоровых доноров в возрасте 54,4 ± 20,6 лет. Диагноз КРР устанавливался на основании клинических, лабораторных, эндоскопических и морфологических методов исследования. Было диагностировано 6 человек с I стадией КРР (14,3%), 15 — с II (37%), 12 — с III (28,6%) и 9 больных с IV стадией (20%). Пациенты были разделены на две группы: в первую группу входили больные на I и II стадиях КРР, во вторую  — на III и IV стадиях. Для проведения исследования было получено разрешение Комитета по медицинской этике при Министерстве здравоохранения и социального развития Республики Карелия и Петрозаводском государственном университете (протокол № 25 от 12.02.2013 г.). Проведен анализ фенотипов клеток периферической крови, а также опухоль-инфильтрирующих лимфоцитов (ОИЛ), выделенных из клинических образцов опухолевой ткани (n = 5) больных с III стадией КРР.

Накопление аденозина в межклеточном пространстве происходит в ответ на метаболический стресс и разрушение клетки, т. е. при ишемии, гипоксии, воспалении и травме. В связи с этим интерес представляет исследование активации CD4⁺CD39⁺ клеток в условиях развития воспаления и иммунной супрессии, не связанной с канцерогенезом. В качестве такой группы сравнения были обследованы больные острым панкреатитом (ОП). В эту группу вошли 29 человек в возрасте 44,5 ± 18 лет. Диагноз был поставлен на основе классификации, принятой на IX Всероссийском съезде хирургов в 2000 г. Критериями включения в исследование, были: возраст 18–70 лет, наличие диагноза «острый панкреатит». Критерии исключения: наличие в анамнезе других нозологий, прежде всего новообразований, а также аутоиммунных патологий. Анализ лимфоцитов у больных КРР и ОП проводили до начала терапии.

Процедуру выделения ОИЛ выполняли методом ферментативной дезагрегации. Свежевыделенную ткань измельчали, переносили в среду для ферментативной дезагрегации и инкубировали при постоянном перемешивании в течение 2–3 ч при комнатной температуре. Среду готовили на основе RPMI-1640 (ПанЭко, Россия) с добавлением 10% FBS (HyClone, США), 100 мкг/мл гентамицина (Sigma, США) и 1 мг/мл коллагеназы IV (ПанЭко, Россия). Полученную суспензию пропускали через стерильные фильтры для клеток 70 и 40 мкм. Выделение фракции лимфоцитов проводили на раздельном градиенте фиколла в 75% и 100%, который готовили из фиколл плотностью 1,077 г/см3 (ПанЭко, Россия).

Экспрессию молекул клетками оценивали методом многоцветной проточной цитометрии на приборе Cytomics FC500 (Beckman Coulter, США) с использованием моноклональных антител CD4-FITC, CD8-FITC, CD25-PC5, CD127-PC7 (Beckman Coulter, Франция), CD3-PE, CD16- FITC, CD19-FITC (Сорбент, Россия), FOXP3-PE (eBioscience, США), CD39 (R&DSystems, США) и соответствующих изотипических контролей. Анализ внутриклеточной экспрессии FOXP3 выполняли с применением набора буферов для фиксации и пермеабилизации (eBioscience, США). Экспрессию мРНК CD39 определяли методом ПЦР в реальном времени. Выделение и очистку нуклеиновых кислот проводили с помощью набора «AxyPrep Blood Total RNA Miniprep Kit» (Axygen,  США). Для синтеза кДНК использовали случайные гексапраймеры и MMLV-обратную транскриптазу (Силекс, Россия). Амплификацию кДНК, а также анализ продуктов амплификации в режиме реального времени выполняли с использованием реакционной смеси с интеркалирующим красителем SYBR Green I (Евроген, Россия) на приборе «iCycler Thermal Cycler» (Bio-Rad, США). Анализ полученных данных проводили методом 2^–∆∆Ct, где Сt — пороговый цикл, а ∆Сt — разница между значениями пороговых циклов для референсного (GAPDH) и таргетного (CD39) генов. Итоговый уровень экспрессии исследуемого гена рассчитывали относительно контроля (здоровые доноры), принимая за единицу величину экспрессии исследуемого гена в контроле. Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета программ «Statistica 6.0», достоверность различий между группами рассчитывали по критерию Манна–Уитни при уровне значимости р < 0,05. Для выявления и оценки характера связи между признаками использовали коэффициент ранговой корреляции Спирмена. Данные представлены в виде M ± SD. Исследование выполнено на научном оборудовании «Центра коллективного пользования Федерального исследовательского центра «Карельский научный центр Российской академии наук» (ЦКП КарНЦ РАН).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе определяли содержание CD4⁺CD39⁺ Т-клеток в периферической крови и среди ОИЛ у больных КРР. Обнаружено, что количество CD4⁺CD39⁺ T-клеток на периферии как у здоровых, так и у больных лиц сильно варьирует. При КРР на поздних стадиях содержание CD4⁺CD39⁺ лимфоцитов было выше, чем в контроле (p < 0,05). В то же время у больных с I и II стадиями КРР значительных отличий в содержании CD4⁺CD39⁺ клеток не отмечено (рис. 1).

В опухолевой ткани среди лимфоцитов количество CD4⁺CD39⁺ Т-клеток было в 4 раза выше, чем в периферической крови тех же больных (рис. 2А).

Повышенное содержание CD4⁺CD39⁺ Т-клеток было отмечено и среди CD4⁺ Т-лимфоцитов (рис. 2Б). Также увеличенное количество CD39⁺ клеток среди ОИЛ наблюдалось в популяции Т-клеток, не несущих на своей поверхности CD4 (рис. 2В). При этом в опухолевой ткани доля СD4^–CD39⁺ клеток была больше, чем CD4⁺CD39⁺ (p < 0,05), чего не отмечено среди лимфоцитов, циркулирующих в крови.

Ранее мы исследовали у больных КРР популяционный состав периферических лимфоцитов (Т-клетки и их субпопуляции, В-клетки и NK-клетки, или естественные киллеры) [19]. Результаты цитометрического анализа представлены в табл. 1.

У больных КРР по сравнению с контролем снижено число В-лимфоцитов, как на начальных стадиях развития заболевания, так и на поздних (p < 0,05). Изменения количества CD3⁺ Т-лимфоцитов отмечены для больных с III–IV стадиями КРР. На всех стадиях развития КРР наблюдалось пониженное число CD4⁺ Т-хелперов (p < 0,05) и активированных CD4⁺CD25⁺ Т-клеток (p < 0,05), а также повышенное количество CD8⁺ цитотоксических лимфоцитов (ЦТЛ, p < 0,05). У больных КРР в уровне NK-клеток достоверных различий по сравнению с контролем не выявлено.

Мы выявили связь изменений в популяционном составе лимфоцитов с количеством CD4⁺CD39⁺ Т-клеток у больных КРР. Отмечена отрицательная корреляция между количеством CD3⁺CD4⁺ T-хелперов и CD4⁺CD39⁺ T-клеток (r = –0,60, p < 0,05), между количеством CD3–CD19⁺ В-клеток и CD4⁺CD39⁺ T-клеток (r = –0,40, p < 0,05), а также между значением иммунорегуляторного индекса (отношение клеток CD4⁺/CD8⁺) и количеством CD4⁺CD39⁺ T-клеток (r = –0,58,  p < 0,05). Полученные данные свидетельствуют об участии CD4⁺CD39⁺ T-клеток в иммуносупрессии при развитии КРР.

Важную роль при канцерогенезе играет субпопуляция T_reg-клеток. Кроме того, экспрессия T_reg -клетками молекулы CD39 и участие в генерации внеклеточного аденозина рассматривается как один из основных механизмов супрессии иммунного ответа [15, 16]. Мы исследовали содержание T_reg -клеток с фенотипом CD4⁺CD25⁺CD127^lo/–. У больных с I–II стадиями КРР количество CD4⁺CD25⁺CD127^lo/– T_reg-клеток было увеличено по сравнению со здоровыми донорами, тогда как у больных на поздних стадиях КРР количество этих клеток не отличалось от контроля (табл. 1). Было показано, что в крови онкологических больных на T_reg-клетках (CD4⁺CD25⁺CD127^lo/–, CD4⁺CD25⁺) происходит усиление уровня экспрессии молекулы CD39 (табл. 2).

Как видно из табл. 2, экспрессия CD39 у CD4⁺CD25⁺CD127^lo/– T_reg -клеток увеличивается уже на начальных этапах (I–II стадии) развития опухоли по сравнению с контролем и достигает максимальных значений у больных с более поздними стадиями КРР. Такая же закономерность наблюдалась и для CD4⁺CD25⁺ T_reg-клеток. Тогда как у клеток с фенотипом CD4⁺CD25^– уровень экспрессии CD39 был довольно низким и не отличался от контроля.

Кроме того, в данной работе исследовали экспрессию транскрипционного фактора T_reg-клеток FOXP3 и ее связь с экспрессией CD39. Показано, что между экспрессией CD39 и экспрессией FOXP3 в CD4⁺CD25⁺ Т-клетках в крови больных КРР существует прямая корреляция (r = 0,51, p < 0,05). Среди ОИЛ CD4⁺CD25⁺ T_reg -клетки также отличались от периферических более высокой экспрессией CD39. При этом почти все ОИЛ с фенотипом CD4⁺CD25⁺ экспрессировали маркер CD39 (табл. 2). Однако повышенная экспрессия этой молекулы наблюдалась и у нерегуляторных клеток с фенотипом CD4⁺CD25^– по сравнению с периферическими лимфоцитами этих же больных. Полученные данные свидетельствуют о том, что опухоль стимулирует экспрессию CD39 на различных субпопуляциях CD4⁺ Т-лимфоцитов, включая T_reg -клетки.

Исследование изменения субпопуляционного состава лимфоцитов и относительного количества T_reg-клеток проводили и у больных ОП (табл. 1). Содержание Т-лимфоцитов и CD4⁺ Т-клеток, а также количество активированных Т-хелперов у больных ОП было ниже, чем в контроле. Однако уровень экспрессии CD25 в Т-хелперах больных ОП был выше, чем в контроле (25,37 ± 8,6% и 18,09 ± 7,5% от числа CD4⁺ T-клеток соответственно, p < 0,05). Изменения в соотношении субпопуляций Т-клеток отразились в значительном снижении иммунорегуляторного индекса (ИРИ). Показано, что у больных ОП увеличено содержание CD8⁺ ЦТЛ и NK-клеток по сравнению со здоровыми донорами. Таким образом, больные ОП, так же как больные КРР проявляли признаки ослабления иммунитета. Кроме того, было обнаружено, что у больных ОП число периферических CD4⁺CD25⁺CD127^lo/– T_reg-клеток выше, чем в контроле (табл. 1).

В результате исследования экспрессии молекулы эктонуклеотидазы CD39 было обнаружено, что у больных ОП количество CD4⁺CD39⁺ T-клеток составило 9,16 ± 2,9% от CD4⁺ Т-клеток. Показано, что в уровне экспрессии CD39 T_reg-клетками больных ОП наблюдалась схожая с КРР закономерность. Экспрессия этой молекулы была выше в T_reg-клетках (p < 0,05) у больных ОП. Так, уровень экспрессии CD39 T_reg-клетками с фенотипом CD4⁺CD25⁺ у больных ОП составил 57,98 ± 19,6%, тогда как в CD4⁺CD25⁺CD127^lo/– T_reg-клетках — 62,09 ± 16,4%. У CD4⁺CD25^– лимфоцитов, не относящихся к T_reg-клеткам, уровень экспрессии CD39 составил 7,67 ± 4,3%, достоверных отличий от контроля не выявлено.

Как и при КРР, мы исследовали степень вовлеченности популяции CD4⁺CD39⁺ T-клеток в иммунную супрессию больных ОП. Однако в результате корреляционного анализа содержания CD4⁺CD39⁺ T-клеток, уровня экспрессии этой молекулы в CD4⁺CD25⁺CD127^lo/– T_reg -клетках и количественных изменений в популяционном составе лимфоцитов больных ОП не выявили ни одной достоверной связи, как это было при КРР.

Кроме того, нами был исследован относительный уровень экспрессии мРНК гена CD39 в лейкоцитах периферической крови больных КРР и ОП. Обнаружено, что у больных КРР уровень мРНК этого гена был в 2,36 раза выше, чем в контроле (рис. 3). У больных ОП не было выявлено существенных отличий в уровне экспрессии транскриптов CD39.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Внеклеточный аденозин — сигнальная молекула, модулирующая многие физиологические процессы. В последнее время активно исследуется аденозин- опосредованная супрессия иммунного ответа как один из ключевых механизмов резистентности опухоли к иммунологическому надзору. Образуется аденозин дефосфорилированием аденозинмонофосфата (АМФ) в межклеточном пространстве. Одним из ключевых ферментов в этом процессе служит эктонуклеотидаза CD39, обеспечивающая превращение аденозинтрифосфата (АТФ) и аденозиндифосфата (АДФ) до АМФ [8, 9].

В настоящей работе исследовали роль СD4⁺ Т-клеток, экспрессирующих CD39, в формировании иммунной супрессии у больных КРР. Нами было показано, что у больных КРР накопление периферических CD4⁺CD39⁺ клеток происходит на поздних стадиях развития опухоли. Среди ОИЛ количество CD4⁺ Т-клеток, экспрессирующих молекулу CD39, значительно выше, чем в крови тех же больных. Кроме того, у обследованных онкологических больных существует отрицательная корреляция между содержанием CD4⁺CD39⁺ T-клеток и другими показателями, такими как количество CD3⁺CD4⁺ T-хелперов, CD3–CD19⁺ В-клеток и значение ИРИ, что свидетельствует об участии CD4⁺CD39⁺ T-клеток в иммуносупрессии при развитии КРР.

Важную роль в формировании иммунной супрессии при канцерогенезе и поддержании опухолевого роста отводят популяции T_reg-клеток. Недавно было продемонстрировано, что Т_reg-клетки могут участвовать в накоплении внеклеточного аденозина. Они отличаются от других Т-лимфоцитов повышенной экспрессией молекулы CD39, необходимой для супрессорной активности этих клеток [20, 21]. Было показано, что T_reg-клетки, выделенные из крови CD39^–/–-мышей проявляют низкий уровень супрессорной активности in vitro и не могут предотвращать отторжение трансплантата in vivo [22]. Поверхностная экспрессия CD73 (нуклеотидазы, дефосфорилирующей АМФ до аденозина) совместно с CD39 определяется у CD4⁺CD25⁺ T_reg клеток мышей. У человека CD4⁺CD25⁺ Т-клетки обладают крайне низким уровнем экспрессии CD73 [23], но при этом уровень экспрессии CD73 в цитоплазме этих клеток выше по сравнению с CD4⁺CD25^– Т-лимфоцитами [21]. Более того, было продемонстрировано прямое накопление аденозина в культуре T_reg-клеток человека, подтверждающее, что в этих клетках CD73 присутствует в активной форме.

В нашей работе показано, что в крови больных КРР уровень экспрессии маркера CD39 в клетках с фенотипами CD4⁺CD25⁺ и CD4⁺CD25⁺CD127^lo/– был значительно выше у всех обследованных больных. При этом усиление экспрессии эктонуклеотидазы зависело от стадии заболевания. Среди ОИЛ CD4⁺CD25⁺ T_reg-клетки также отличались от периферических более высокой экспрессией этой молекулы. Таким образом, можно заключить, что в результате процесса рекрутинга из периферического пула лимфоцитов, среди ОИЛ происходит накопление T_reg-клеток с высокой экспрессией CD39⁺. Эти клетки являются одной из доминирующих субпопуляций T_reg при развитии КРР, особенно на более поздних стадиях заболевания. Кроме того, CD39⁺ T_reg-клетки отличает более высокая иммуносупрессорная активность, что может оказывать негативный эффект при развитии заболевания наряду с другими механизмами иммунной супрессии.

Развитие ОП, особенно в деструктивной форме, тоже  сопровождается изменением реактивности иммунной системы. Это заболевание характеризуется воспалением поджелудочной железы с возможным вовлечением перипанкреатических тканей и формированием полиорганной функциональной недостаточности, которая в свою очередь возникает в следствие панкреонекроза, развития инфекции и сепсиса [24]. Предполагается, что выраженность иммунных характеристик синдрома системного воспалительного ответа может индуцировать развитие иммуносупрессии, что приводит к неспособности организма противостоять микробной агрессии и, как следствие, к развитию гнойно- некротических осложнений [25].

Полученные нами данные об изменениях в субпопуляционном составе лимфоцитов, повышенном содержании T_reg-клеток у больных ОП могут свидетельствовать о развитии иммунной супрессии при данном заболевании. Учитывая повышенное содержание T_reg-клеток, а также воспалительный характер заболевания и увеличение уровня апоптоза циркулирующих лимфоцитов [26], предполагается, что развитие иммунной супрессии у таких больных представляет компенсаторный механизм, ограничивающий развитие воспалительной реакции.

В отличие от пациентов с КРР, у больных ОП содержание CD4⁺CD39⁺ клеток не отличалось от контроля. Не выявлено корреляции между содержанием основных популяций лимфоцитов и уровнем CD4⁺CD39⁺ T-клеток. Отмечено, что у больных ОП был увеличен уровень экспрессии CD39 на T_reg-клетках (CD4⁺CD25⁺ и CD4⁺CD25⁺CD127^lo/–) по сравнению с контролем, что, возможно, связано с повышенным количеством самих T_reg-клеток в крови этих больных. По-видимому, у больных ОП CD4⁺СD39⁺ Т-клетки не вносят значительного вклада в развитие системной иммуносупрессии, как при канцерогенезе. Об этом также свидетельствуют полученные нами результаты анализа относительного уровня мРНК гена CD39 у больных КРР и ОП. Было показано, что у больных КРР уровень мРНК CD39 увеличивался в процессе развития заболевания, достигая максимальных значений на поздних стадиях КРР. В то же время, у больных ОП уровень экспрессии CD39 не отличался от контроля.

ВЫВОДЫ

В условиях развития КРР значительно повышается количество CD4⁺ Т-клеток, экспрессирующих маркер CD39, особенно интенсивное накопление CD39⁺ клеток наблюдается среди ОИЛ. Эти клетки играют существенную роль в формировании иммунной супрессии у больных КРР. Значительную долю клеток, экспрессирующих CD39, составляют T_reg-лимфоциты. Блокировка экспрессии эктонуклеотидазы CD39 и/или ограничение функционирования T_reg-клеток представляет интерес для разработки новых подходов к противоопухолевой терапии. Необходимы дальнейшие исследования для детального понимания механизмов аденозин-А2АR-опосредованной иммунной супрессии у онкологических больных.