Лекарственно-устойчивый туберкулез (ТБ) представляет собой серьезную проблему для здравоохранения. Основное внимание в настоящее время сосредоточено на борьбе с туберкулезом с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ ТБ), т. е. туберкулезом такой формы, при которой возбудитель устойчив одновременно к двум наиболее эффективным противотуберкулезным препаратам (ПТП) — изониазиду и рифампицину [1]. Россия занимает третье место в мире по распространенности МЛУ ТБ [2]. В 2018 г. показатели заболеваемости и распространенности МЛУ ТБ в РФ стабилизировались и составили соответственно 5,6 и 23,6 на 100 000 человек населения. При этом доля пациентов с МЛУ ТБ среди бактериовыделителей увеличилась (с 27,4% в 2017 г. до 29,3% в 2018 г. среди новых случаев ТБ и с 54,0% в 2017 г. до 55,3% в 2018 г. среди всех пациентов с ТБ органов дыхания, выделяющих микобактерии туберкулеза) [3].
На этом фоне другим формам резистентности уделяют недостаточное внимание. Одной из таких форм, выделяемых ВОЗ в отдельную группу, является туберкулез, резистентный к изониазиду (Hr-TB, ИР-ТБ), который характеризуется устойчивостью возбудителя к изониазиду и чувствительностью к рифампицину [4]. Изониазид — ПТП 1-го ряда, высокоэффективный для лечения активного туберкулеза, оказывающий бактерицидное воздействие на M. tuberculosis. Фенотипическая резистентность к изониазиду ассоциирована с мутациями в ряде генов (katG, inhA, ahpC и др.), продукты которых вовлечены в фармакокинетику и фармакодинамику изониазида в бактериальной клетке [5, 6].
Неадекватная терапия ИР-ТБ создает высокие риски для формирования приобретенной лекарственной устойчивости к другим противотуберкулезным препаратам, в том числе к рифампицину, приводя к развитию МЛУ [7]. По данным ВОЗ, распространенность ИР-ТБ составляет 5–11% в зависимости от региона [8]. Сведений о распространенности ИР-ТБ в России недостаточно.
Цель исследования: охарактеризовать частоту встречаемости ИР M. tuberculosis, выделенных у больных туберкулезом легких из клинических отделений ФГБНУ «ЦНИИТ» за период 2011–2018 гг., дать расширенную характеристику фенотипической чувствительности и описать генетические детерминанты устойчивости к изониазиду этой группы M. tuberculosis.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объект исследования

Исследовали клинические изоляты M. tuberculosis и/или ДНК M. tuberculosis, выделенные из диагностического материала, полученного от каждого пациента, поступившего в консультационное и клинические отделения ФГБНУ «ЦНИИТ» (за период 2011–2018 гг.). Все виды микробиологических исследований проводили из одной порции диагностического материала.

Культуральная диагностика

Выявление M. tuberculosis проводили на жидкой среде Middlebrook 7H9 в системе BACTEC MGIT 960 (BD; USA) согласно стандартному протоколу изготовителя [9]. Фенотипическую лекарственную чувствительность определяли модифицированным методом пропорций в системе BACTEC MGIT 960 (BD; США) к восьми противотуберкулезным препаратам в критических концентрациях: изониазид (H, 0,1 мкг/мл), рифампицин (R, 1,0 мкг/мл), этамбутол (E, 5,0 мкг/мл), пиразинамид (Z, 100,0 мкг/мл), этионамид (Eto, 5,0 мкг/мл), амикацин (Am, 1,0 мкг/мл), капреомицин (Cm 2,5 мкг/мл) и левофлоксацин (Lfx 1,0 мкг/мл) согласно стандартным процедурам [9, 10].

Выделение ДНК

ДНК выделяли из диагностического материала набором реагентов «Амплитуб-РВ» для выделения, обнаружения и количественного определения ДНК микобактерий туберкулезного комплекса методом ПЦР в реальном времени, комплект № 1 («Синтол»; Россия), согласно инструкции производителя.
ДНК M. tuberculosis определяли с использованием набора реагентов «Амплитуб-РВ» для выделения, обнаружения и количественного определения ДНК микобактерий туберкулезного комплекса методом ПЦР в реальном времени, комплект № 2 («Синтол»; Россия), согласно инструкции производителя. Амплификацию проводили в термоциклере с оптическим модулем CFX96 (Bio-Rad; США).
Определение генотипической ЛУ к рифампицину, изониазиду и фторхинолонам проводили или с использованием микрочиповой технологии с наборами «ТБ-БИОЧИП-1» и «ТБ-БИОЧИП-2» («БИОЧИП-ИМБ»; Россия), или с использованием наборов «Амплитуб-МЛУ-РВ» и «Амплитуб-FQ-РВ» («Синтол»; Россия). Процедуры осуществляли согласно инструкциям производителей.

Статистическая обработка результатов

При оценке результатов исследования использовали описательную статистику: количество наблюдений, частота, доля (в %), 95%-й доверительный интервал (95% ДИ). Весь анализ проводили с использованием MS Excel (Microsoft; США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Были проведены культуральные и молекулярно-генетические исследования диагностического материала от 4056 больных туберкулезом легких. В 71 случае ни ДНК M. tuberculosis, ни культура M. tuberculosis не были выделены; эти случаи были исключены из исследования. Из оставшихся 3985 образцов диагностического материала были выделены ДНК и/или культуры M. tuberculosis и определена фенотипическая/ генотипическая чувствительность к ПТП. При получении результатов для клинических изолятов M. tuberculosis и культуральным, и молекулярно-генетическим методом (МГМ), в случае их несовпадения, приоритет отдавался данным, полученным культурально (табл. 1). Так, 38 штаммов, для которых при исследовании культуральным методом была определена устойчивость одновременно к изониазиду и рифампицину, но не были определены мутации в rpoB, обусловливающем устойчивость к рифампицину, были отнесены к категории МЛУ, так как использованные нами тесты для молекулярно-генетического определения ЛУ фиксируют только ограниченное число мутаций, поэтому генетические детерминанты устойчивости к рифампицину в этих случаях могли быть не выявлены. И наоборот, 29 штаммов с выявленными мутациями в rpoB, которые не имели фенотипического проявления в виде формирования устойчивости к рифампицину, были отнесены к категории ИР.

Среди устойчивых штаммов доминировали штаммы с МЛУ (см. табл. 1), однако штаммы с устойчивостью к изониазиду при сохраненной чувствительности к рифампицину также были достаточно широко представлены (502/3985; 12,60%).
Исследование динамики выявления M. tuberculosis с ИР за период 2011–2018 гг. показало, что в 2011–2012 и 2017–2018 гг. частота выявления ИР-ТБ среди всех исследованных за год случаев туберкулеза составила около 14%. В 2013–2016 гг. частота выявления этой формы ТБ была ниже (на уровне 10–11%). Линейный тренд показателя с достаточной степенью надежности описать не удалось (табл. 2).
Так как культуральные методы диагностики туберкулеза обладают меньшей чувствительностью, чем молекулярно-генетические, часть образцов не дали рост культуры M. tuberculosis на питательных средах. Поэтому фенотипическая чувствительность к ПТП была определена только для 260 изолятов M. tuberculosis с ИР (табл. 3).
При классификации по характеру лекарственной резистентности изолятов M. tuberculosis с ИР опирались на следующие определения [1]: монорезистентность — устойчивость микобактерий туберкулеза только к одному из ПТП; полирезистентность — устойчивость микобактерий туберкулеза к двум и более противотуберкулезным препаратам, но не к сочетанию изониазида и рифампицина.
Изоляты с моноустойчивостью к изониазиду выделяли в 117/260 (45%) случаев. Остальные 143 (55%) образца относились к полирезистентным и были устойчивы к 2–6 препаратам. Среди полирезистентных изолятов приблизительно в равных долях обнаружены M. tuberculosis с устойчивостью к изониазиду в комбинации только с ПТП 1-го ряда (42/143; 29,37%) и в комбинации только с ПТП 2-го ряда (38/143; 26,57%), причем во втором случае почти всегда регистрировали устойчивость к этионамиду (31/38; 81,58%). Наибольшее число полирезистентных изолятов было устойчиво одновременно к препаратам 1-го и 2-го рядов (63/143; 44,06%). Из них устойчивость одновременно к изониазиду, этамбутолу и этионамиду (HEEto), в том числе в сочетании с другими ПТП 2-го ряда, была выявлена в 20/63 (31,75%) случаев; устойчивость к изониазиду, пиразинамиду и этионамиду (HZEto), в том числе в сочетании с другими ПТП 2-го ряда, встречалась реже — в 9/63 (14,29%) случаев; и устойчивость к HEZEto — в 15/63 (23,81%) случаев. У 19/63 (30,16%) изолятов в спектрах резистентности были представлены другие сочетания препаратов (12 спектров резистентности, включающих от 3 до 5 ПТП).
Данные о мутациях в генах, ассоциированных с устойчивостью к изониазиду, были получены для 451 изолята M. tuberculosis с ИР (табл. 4). Чаще всего выявляли единичные однонуклеотидные полиморфизмы (ОНП) в одном из генов, ассоциированных с устойчивостью к изониазиду, — в 386/451 (85,59%) случаев; реже ОНП обнаруживали в двух генах, ассоциированных с устойчивостью к изониазиду, — в 65/451 (14,41%) случаев. Доминировали мутации в 315-м кодоне katG — 413/451 (91,57%), причем только в этом гене — в 348/413 (84,26%) случаев, реже в сочетании с ОНП в inhA — в 62/413 (15,01%) случаев, в единичных образцах — в сочетании с ОНП в ahpC.

Достаточно часто (94/451; 20,84%) регистрировали замену inhA15_C->T, которая в виде единичной мутации встречалась в 33/94 (35,11%) образцов, в остальных случаях эта мутация была сочетанной с ОНП в 315 кодоне katG.
Для 209 изолятов M. tuberculosis с ИР, устойчивость которых к изониазиду была подтверждена фенотипически, получили подобное распределение мутантных вариантов: 152/209 (72,73%) имели единичную мутацию katG315_ Ser->Thr(1); 32/209 (15,31%) — сочетанные мутации katG315_Ser->Thr(1) + inhA15_C->T; 17/209 (8,13%) — единичную inhA15_C->T. Оставшиеся 8 (3,83%) изолятов с подтвержденной фенотипической ИР несли мутации в других регионах генов, ассоциированных с устойчивостью к изониазиду (единичные в ahpC10_C->T, katG315_Ser->Asn; сочетанные katG315_Ser->Gly + inhA15_C->T, katG315_Ser->Thr(1) + inhA8_T->G; katG315_Ser->Thr(1) + ahpC10_C->T).
Таким образом, среди M. tuberculosis с ИР доминирующей мутацией была единичная мутация katG315_Ser->Thr(1), которая соответствует нуклеотидной замене AGC->ACC (333/451; 73,84%), далее по убыванию выявлены сочетанные мутации katG315_Ser->Thr(1) + inhA15_C->T (60/451; 13,30%) и единичная мутация inhA15_C->T (33/451; 7,32%). В целом, на долю этих трех мутантных вариантов приходилось 426/451 (94,46%) M. tuberculosis с ИР.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Изучена частота встречаемости устойчивости к изониазиду с сохраненной чувствительностью к рифампицину у M. tuberculosis, выделенных от больных туберкулезом легких из клинических отделений ФГБНУ «ЦНИИТ» за период 2011–2018 гг.
Частота встречаемости этой формы ТБ и динамика распространения популяции в разных регионах мира имеют свою специфику. Так, при анализе данных по лекарственной чувствительности возбудителя туберкулеза, представленных в ВОЗ за период 1994–2009 гг. из 131-го противотуберкулезного учреждения со всего мира, наибольшая частота встречаемости ИР-ТБ была зарегистрирована в Восточной Европе (15%), меньше — в Западной и Центральной Европе (11%), а в остальных регионах ВОЗ не превышала 8% [11]. Для ряда регионов этими авторами была показана тенденция к снижению распространенности данной формы туберкулеза, для других, напротив, повышение, но в большинстве регионов не было установлено четкой линейной динамики показателя. Описанная нами частота встречаемости ИР M. tuberculosis (12%) сходна с показателями, характерными для Восточной Европы, а динамика показателя, также как в большинстве регионов, была нелинейной.

В систематическом обзоре, посвященном связи первичной резистентности к изониазиду с приобретением резистентности к другим ПТП [12], было сделано заключение, что приобретенная устойчивость к любому ПТП (не только переход в МЛУ) у моноустойчивых к изониазиду штаммов возникает в 5,1 раз чаще по сравнению с лекарственно-чувствительными штаммами. Показанная в нашем исследовании высокая частота встречаемости полирезистентных штаммов (55% от всех ИР), устойчивых кроме изониазида дополнительно к 1–5 ПТП, подтверждает возможность амплификации лекарственной устойчивости у M. tuberculosis с ИР.
Так как стандартный курс химиотерапии по I режиму, часто назначаемый эмпирически при новых случаях туберкулеза, включает в себя ПТП 1-го ряда — этамбутол и пиразинамид, логично было ожидать выявление высокой доли устойчивости M. tuberculosis с ИР именно к этим препаратам. Действительно, устойчивость к этамбутолу была выявлена почти у половины полирезистентных M. tuberculosis (70/143, 48,95%; 95% ДИ: 40,89–57,06%) и чуть реже регистрировали устойчивость к пиразинамиду (57/143, 39,86%; 95% ДИ: 32,20–48,05%).
Однако еще чаще у полирезистентных M. tuberculosis определяли устойчивость к препарату 2-го ряда этионамиду (80/143, 55,94%; 95% ДИ: 47,76–63,82%). Полученный результат можно объяснить тем, что этионамид является структурным аналогом изониазида и также угнетает синтез миколовых кислот, нарушая построение клеточной стенки микобактерий, поэтому эти два препарата могут иметь общие мишени и генетические детерминанты устойчивости [5, 13].

В целом, терапия ИР форм ТБ препаратами 1-го ряда по стандартной схеме приводит к неоптимальным результатам терапии (неэффективное лечение, рецидивы, приобретенная МЛУ). Кроме того, стандартизованное эмпирическое лечение ИР-ТБ может в значительной степени способствовать развитию эпидемии ТБ с МЛУ, особенно в тех регионах, где часто встречается ИР-ТБ [7]. В то же время своевременная коррекция терапии при получении данных о наличии устойчивости к изониазиду и применение модифицированных схем гарантировали успех лечения и не приводили к рецидивам [14–16].
В связи с этим следует упомянуть два клинических исследования, задачей которых было установить зависимость от мутаций в геноме возбудителя эффективности терапии высокими дозами изониазида ИР формы ТБ [17, 18]. Известно, что мутации в katG (доминировали в нашем исследовании) приводят к высокому уровню резистентности к изониазиду, а мутации только в inhA — к низкому уровню резистентности [5]. По итогам клинических исследований, терапия изониазидом была эффективна в том случае, если у возбудителя выявляли мутации на уровне inhA, а неблагоприятные исходы лечения были при мутациях на уровне katG [17, 18].

Все вышесказанное свидетельствует о том, что необходима отработка эффективных схем терапии ИР-ТБ [8, 19]. Кроме того, важно уделять внимание ускоренной диагностике ЛУ к изониазиду. Быструю специфичную и чувствительную диагностику ЛУ M. tuberculosis могут обеспечить только молекулярно-генетические методы (1–2 дня по сравнению с несколькими неделями культуральной диагностики), которые также дают возможность получить информацию о мутации и об уровне резистентности к изониазиду возбудителя [1]. Это делает МГМ наиболее востребованными в диагностике туберкулеза и определении лекарственной устойчивости возбудителя. Применяемые в крупных диагностических центрах фтизиатрического профиля тесты, основанные на аллель-специфичной ПЦР, биочипах или ДНК-стрипах, позволяют провести диагностику в кратчайшие сроки, но предъявляют высокие требования к квалификации персонала и инфраструктуре лабораторий.

В настоящее время единственным молекулярным тестом, который можно применять в лабораториях всех уровней, является Xpert MTB/RIF на платформе GeneXpert [20]. Но так как диагностика сегодня сосредоточена на выявлении МЛУ, маркером которой служит устойчивость к рифампицину, этот тест диагностирует только генотипическую устойчивость к рифампицину. Следовательно, устойчивость только к изониазиду без устойчивости к рифампицину (12% в нашем случае) не будет определена с использованием этого метода диагностики, а при невозможности применения дополнительных диагностических тестов никогда не будет установлена и, следовательно, из-за неадекватной химиотерапии может способствовать появлению новых случаев МЛУ. Поэтому актуальна разработка простого молекулярно-генетического теста, который может быть внедрен повсеместно и по удобству использования будет подобен Xpert MTB/RIF.

ВЫВОДЫ

Туберкулез с ИР возбудителя можно рассматривать как потенциального предшественника туберкулеза с МЛУ. Поэтому важно контролировать распространение первичной устойчивости к изониазиду и предотвращать амплификацию устойчивости. Анализ частоты встречаемости устойчивости к изониазиду с сохраненной чувствительностью к рифампицину у M. tuberculosis, выделенных от больных туберкулезом легких, показал достаточно высокий уровень встречаемости ИР-TБ (более 12% от всех проанализированных случаев) — как правило с мутациями, приводящими к высокому уровню резистентности к изониазиду. Полученные данные подчеркивают важность ускоренного определения молекулярно-генетическими методами лекарственной чувствительности M. tuberculosis одновременно к рифампицину и изониазиду в лабораториях всех уровней. Для обеспечения этой возможности необходима разработка новых простых тестов в формате point-of-care, не предъявляющих высоких требований к инфраструктуре лаборатории.