Pseudomonas aeruginosa является одним из важнейших оппортунистических патогенов, который наносит человечеству серьезный урон в медицинской и экономической сферах [1]. Особенно опасны устойчивые к карбапенемам штаммы P. aeruginosa, которые эксперты ВОЗ расценивают как критически опасные патогены [2]. В связи с этим исследование механизмов возникновения карбапенем-резистентности является актуальной задачей современной медицинской микробиологии. При исследовании молекулярногенетической базы карбапенемрезистентности чаще уделяют внимание β-лактамазным механизмам, которые детерминируются плазмидными генами и могут передаваться горизонтальным путем. Однако существует и мутационная изменчивость, затрагивающая гены кор-генома P. aeruginosa и приводящая к развитию карбапенем-резистентности достаточно высокого уровня [3]. Изучение мутаций, индуцирующих карбапенемрезистентность, проводят в двух направлениях. Первый подход направлен на исследование изолятов c признаками сформировавшейся резистентности, полученных из клинических, сельскохозяйственных источников или из окружающей среды. Второе направление основано на моделировании эволюции резистентности в условиях in vitro. Обычно резистентность воспроизводят путем культивирования бактерий в повышающихся концентрациях антибиотика. Разработан весьма удачный способ исследования мутационной резистентности [4]. Его авторы предложили пространственно-временную модель, которая обеспечивала движение Escherichia coli в градиенте повышения концентраций триметоприма или ципрофлоксацина и позволяла изолировать множество клональных вариантов бактерии с целью изучения их мутационной изменчивости. Однако в геномах новых клонов E. coli обнаружены мутации, которые не направлены на повышение устойчивости к триметоприму либо ципрофлоксацину [4]. Нас заинтересовал актуальный вопрос о направленности последствий подобных мутаций. В частности, практически значимой является возможность мутаций, возникающих под воздействием какого-либо антибиотика, индуцировать резитентность к другим антибиотикам (феномен кросс-резистентности) [5, 6]. Целью работы было исследование возникновения кроссрезистентности у P. aeruginosa в процессе адаптации к популярному антибиотику меропенему.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Бактериологические исследования

Исследование проводили на основе пространственновременной модели формирования резистентности подвижных бактерий к антибиотикам [4]. Референтный штамм P. aeruginosa ATCC 27853 предварительно культивировали (24 ч при 37 °С) на чашке Петри с полужидким агаром Луреа–Бертани (содержание агарозы — 0,28%), спустя сутки выполняли пересев на другую чашку Петри с полужидким агаром Луреа– Бертани, забирая материал с края распространившейся колонии. Процедуру выполняли трижды. Затем при помощи бактериальной петли (10 мкл) уколом в верхний слой полужидкого агара выполняли пересев бактерий на верхний слой (полужидкий агар) питательной среды в устройстве, схема которого представлена на рисунке (рисунок). Среда в устройстве имела «сэндвич»-структуру. Нижний слой был изготовлен из бульона Луреа–Бертани (LB Miller, Becton Dickinson, США), содержащего 1,6% агарозы, 30 мкг/мл канамицина сульфата, 100 мкг/мл циклогексимида и меропенем в расчетной концентрации (см. рисунок).  Оптимальная толщина нижнего слоя составляла 3/5 от общей толщины «сэндвич»-среды (примерно 2,0 см). Нижний слой разливался в пять изолированных отсеков, в каждом из отсеков содержалась среда с разными концентрациями меропенема. Средний слой (1/5 от общей толщины «сэндвич»-среды) был изготовлен из бульона Луреа–Бертани (модификация Миллер), содержащего 2,0% агарозы, 30 мкг/мл канамицина сульфата, 100 мкг/мл циклогексимида с добавлением туши (4,0 мл на 1 л среды) для контрастирования бактериальных колоний при фотофиксации их роста; он наслаивался поверх отсеков нижнего слоя и был сплошным. Верхний слой (1/5 общей толщины среды) представлял собой полужидкий агар (бульон Луреа– Бертани в модификации Миллер, содержащий 0,3% агарозы, 30 мкг/мл канамицина сульфата, 100 мкг/мл циклогексимида).

Инкубацию проводили при 37 °С в течение 216 ч в аэробных условиях. Каждые 12 ч с фронта распространения P. aeruginosa отбирали образцы и пересевали на агар Мюллера–Хинтон (Becton Dickinson; США) для накопления биоматериала с целью последующего изучения фенотипических свойств (профиль антибиотикорезистентности) и изменений бактериального генома.

Оценку чувствительности изолятов к меропенему и имипенему выполняли при помощи метода дилюции в агаре [7]. Оценку чувствительности изолятов к колистину (при помощи метода серийных разведений) и интерпретацию полученных результатов выполняли в соответствии с протоколом Института клинических и лабораторных стандартов США (Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)) [8].

Бактериальную ДНК выделяли из суточных культур изолятов P. aeruginosa, выращенных на агаре Мюллера– Хинтон (Becton Dickinson; США), с использованием наборов QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen; Германия) по протоколу фирмы-производителя. Образцы ДНК хранили при –20 °C.

Для подготовки библиотек геномной ДНК применяли ультразвуковую фрагментацию (Covaris; США) бактериальной ДНК (400 нг) с последующей репарацией концевых последовательностей и лигированием адаптеров (MGI; Китай). Для очистки ДНК-библиотек использовали магнитные частицы Agencourt AMPure XP (Beckman; США). Концентрацию бактериальной ДНК и ДНК-библиотек измеряли при помощи прибора Qubit 4 (Thermo Fisher Scientific; США).

Полногеномное секвенирование осуществляли на платформе MGISEQ-2000 (MGI; Китай). Длина прочтений составляла 250 пар оснований.

Оценку качества ридов и их подготовку проводили с использованием программ FASTQC и Trimmomatic v.0.38. Сборку геномов de novo осуществляли с использованием программы SPAdes 3.14 [9]. Для контроля полноты сборки и исключения возможности контаминации использовали веб-сервер Contest16S. Качество сборки оценивали при помощи QUAST 5.0 [10]. Анализ сходства полных геномов проводили с использованием программы MUMmer [11]. Геномы аннотировали с помощью сервера RAST [12] и программы Prokka [13]. Для детекции однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) осуществляли картирование коротких ридов на референс при помощи программы Snippy [14]. В качестве референсного генома использовали геном ATCC 27853. Для аннотации выявленных вариантов и предсказания их влияния на гены применяли программу SnpEff [15]. Поиск и анализ генов резистентности, а также валидацию выявленных однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) осуществляли при помощи BLASTn в собранных геномах de novo. Для анализа детерминант резистентности также использовали сервисы ResFinder и алгоритм AMRFinderPlus, входящий в NCBI Pathogen Detection pipeline [16, 17].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Всего в течение 216 ч инкубации было получено 93 изолята P. aeruginosa с различными фенотипическими свойствами (цвет колоний, профиль антибиотикорезистентности, наличие слизи) и мутациями в геномах. Среди этих изолятов было обнаружено два штамма (Е62  был получен через 192 ч инкубации и Е74 — через 216 ч инкубации), у которых зарегистрировано значительное снижение чувствительности к колистину (в 4–8 раз) при высоких уровнях резистентности к меропенему и имипенему. Фенотипические и генетические особенности этих штаммов представлены в таблице (таблица).

Показатели МПК меропенема и имипенема у штамма Е62 составляли соответственно 16 и 128 мкг/мл, у штамма E74 — 16 и 256 мкг/мл, что соответствовало критерию резистентности. Показатель чувствительности к колистину у штамма Е62 интерпретировали в соответствии с критериями CLSI как «чувствительный при повышенной экспозиции антибиотика», и его превышение МПК исходного штамма было в 4 раза. Штамм Е74 согласно критериям CLSI был резистентным (МПК — 4 мкг/мл).

У обоих штаммов в гене порина oprD была идентифицирована мутация, приводящая к замене глицина на аспарагиновую кислоту в позиции 307 белка. Кроме того, у обоих штаммов была детектирована миссенсмутация в гене mexD (кодирует субъединицу эффлюксной системы MexCD-OprJ). В гене phoQ у штаммов E62 и E74 была выявлена нонсенс-мутация, приводящая к преждевременной остановке синтеза продукта (289/448 аминокислот).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Существование штаммов P. aeruginosa, демонстрирующих устойчивость одновременно к карбапенемам и полимиксинам, нередкое явление. Например, показано, что среди P. aeruginosa с множественной лекарственной устойчивостью 22,2% от общего количества меропенемрезистентных изолятов были нечувствительны к колистину [18]. В большинстве исследований отсутствует описание эволюции таких изолятов — не исключается возможность формирования подобного профиля резистентности вследствие поочередного или одновременного терапевтического применения карбапенемов и колистина. Описанный нами феномен очень интересен именно потому, что доказывает возможность снижения чувствительности к колистину после воздействия на P. aeruginosa меропенема. Гипотетические механизмы индукции меропенемом кросс-резистентности к колистину укладываются в постулат «у синегнойной палочки все пути ведут к резистентности», подразумевающий, что любой стресс вызывает гипермутабельность и возникновение большого количества клонов с новыми свойствами [3]. С известной долей вероятности в результате такого мутационного «взрыва» могут возникать и зарепляться мутации, приводящие к нарушению синтеза главной мишени колистина — липополисахарида.

В геномах штаммов Е62 и Е74 были обнаружены мутации, объясняющие их устойчивость к меропенему/имипенему и снижение чувствительности к колистину. Выявленная нами миссенс-мутация в гене oprD могла вызывать изменение структуры порина OprD, транспортирующего меропенем и имипенем внутри бактериальной клетки [19]. Поиск в базе данных GeneBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ genbank) позволил выявить один клинический изолят с аналогичной аминокислотной последовательностью порина OprD (номер генома в GeneBank — GCA_003194245.1). Данный изолят, выделенный в 2013 г., тоже был устойчив к меропенему и имипенему (МПК меропенема и имипенема — > 32 мкг/мл). Другой мутацией, которая могла снижать уровень чувствительности к карбапенемам, является миссенс-мутация в гене mexD, кодирующем субъединицу эффлюксной системы MexCD-OprJ. Система MexCD-OprJ вовлечена в эффлюкс β-лактамов и ее гиперэкспрессия коррелирует с устойчивостью P. aeruginosa к карбапенемам [20]. Ген phoQ кодирует сенсорную гистидинкиназу, являющуюся частью двухкомпонентной регуляторной системы PhoPQ. Мутации, вызывающие поломки гена phoQ, описаны как причина устойчивости к полимиксинам у изолятов P. aeruginosa, в том числе выделенных от пациентов с муковисцидозом [21, 22].

Таким образом, все фенотипические особенности карбапенем-резистентных изолятов со сниженной чувствительностью к колистину имели мутационную основу.

ВЫВОДЫ

Феномен кросс-резистентности, описанный в настоящем исследовании, можно объяснить тем, что в условиях стресса у P. aeruginosa возрастает скорость накопления точечных мутаций, в том числе в генах, ответственных за развитие антибиотикорезистентности. Полученные результаты доказывают, что при воздействии меропенема у штаммов P. aeruginosa может развиваться резистентность не только к другим β-лактамным антибиотикам, но и к препарату резерва для лечения синегнойной инфекции — колистину, что крайне неблагоприятно с точки зрения выбора стратегии лечения.