Перераспределение медицинских услуг во время пандемии COVID-19, несомненно, оказало негативное влияние на продолжающуюся эпидемию туберкулеза (ТБ). Острая форма COVID-19 и ТБ могут совпадать, и частота возникновения таких коинфекций в районах с высокой распространенностью ТБ может быть недооценена. Предшествующий или текущий ТБ является фактором риска смерти от SARS-CoV-2. Результаты ex vivo исследований клеток крови остро инфицированных людей показывают, что ответ Т-клеток на Mtb может модулироваться SARSCoV-2. И наоборот, сопутствующий ТБ может ухудшить иммунный ответ на SARS-CoV-2 и усугубить воспалительную реакцию за счет усиления активации врожденного и адаптивного иммунитета. Несмотря на то что исследования на животных и эпидемиологические данные указывают на потенциальную защиту от SARS-CoV-2 с помощью БЦЖ, эффективность вакцины не подтвердилась в ходе нескольких крупномасштабных клинических исследований [1].

В контексте респираторных инфекций пандемия COVID-19 создала новые проблемы для пациентов с уже существующими заболеваниями. Особое беспокойство вызывает взаимодействие между COVID-19 и ТБ, сочетание которых представляет собой сложный клинический ландшафт [2]. Обе респираторные инфекции характеризуются гиперинтенсивным воспалительным процессом с высоким уровнем провоспалительных цитокинов, включая TNF, IL6 и IL1. Эти высвобождающиеся цитокины и хемокины привлекают иммунные клетки, которые усиливают провоспалительные реакции, тем самым способствуя повреждению тканей. Полученные данные подчеркивают серьезность такого взаимодействия, показывая, что одновременное или последовательное инфицирование легких COVID-19 и ТБ приводит к обострению респираторных симптомов и выраженному снижению функции легких [3].

Показано, что ТБ может влиять на тяжесть COVID-19 из-за ослабленного иммунитета и хронического воспаления легких [4]. У пациентов с активным ТБ наблюдается дисрегуляция иммунного ответа, что может нарушить иммунный ответ на COVID-19 и привести к увеличению тяжести заболевания. Кроме того, COVID-19 может реактивировать латентный ТБ у пациентов с историей заболевания, что еще больше усугубляет тяжесть симптомов [5, 6]. Если сравнивать пациентов с ТБ и COVID-19 с пациентами с пневмонией, то у 22% обследованных пациентов с ТБ наблюдались легкие/ умеренные клинические формы заболевания, а у остальных 78% развились более тяжелые формы COVID-19 [7].

Новая коронавирусная инфекция 2019 г. COVID-19 привела к широкомасштабной заболеваемости и смертности [8]. Адаптивный иммунный ответ играет важную роль в контроле большинства вирусных инфекций. Основными фундаментальными компонентами адаптивной иммунной системы являются В-лимфоциты (как источник антител) и Т-лимфоциты (CD4⁺ и CD8⁺). Учитывая то что адаптивные иммунные реакции важны для контроля и устранения почти всех вирусных инфекций, вызывающих заболевания у людей, а адаптивные иммунные реакции и иммунная память играют ключевую роль в формировании вакцинного иммунитета, крайне важно понимать адаптивные реакции на SARS-CoV-2. Как ответ на инфекцию SARS-CoV-2 в организме хозяина вырабатываются специфичные для SARS-CoV-2 антитела, CD4⁺- и CD8⁺-Тлимфоциты [9–11].  Антитела и Т-клетки играют защитную роль в борьбе с вирусными инфекциями, но эти роли и важность каждого компонента адаптивного иммунитета варьируются в зависимости от вида вирусной инфекции. Взаимосвязь между нейтрализующими антителами, T-клетками памяти и тяжестью заболевания COVID-19 представляется сложной. Высокие титры нейтрализующих антител связаны с тяжелым заболеванием и потенциально экстрафолликулярными ответами В-клеток [12, 13], в то время как Т-клетки памяти, специфичные для SARS-CoV-2, имеют разные ассоциации в зависимости от исследования [14–17]. Почти у всех пациентов, перенесших COVID-19, в крови детектируются IgG и Т-лимфоциты CD4⁺ к антигенам SARS-CoV-2. Продемонстрировано, что величина ответа Spike-специфичных Т-клеток CD4⁺ коррелирует с Spike IgG [9, 16, 18]. Тем не менее некоторые люди имеют низкие или отрицательные результаты тестов на IgG, сохраняя при этом обнаруживаемые CD4⁺ T-клетки к SARS-CoV-2. На эти случаи приходится 1–10% инфицированных SARSCoV-2 [19–21].

Целью исследования было провести анализ длительности сохранения клеточной и гуморальной иммунологической памяти к SARS-CoV-2 на фоне ТБ-коинфекции.

ПАЦИЕНТЫ  И МЕТОДЫ

Пациенты

В исследование были включены 120 человек (59 мужчин и 61 женщина) в возрасте от 18 до 70 лет (средний возраст 40 ± 15 лет). Критерии включения: здоровые лица (15 человек) — индивидуумы без COVID-19 и ТБ в анамнезе; лица, перенесшие COVID-19 в срок до 3-х месяцев до момента включения в исследование (без ТБ в анамнезе) (16 человек); лица, перенесшие COVID-19 в срок до 6 месяцев до момента включения в исследование (без ТБ в анамнезе) (19 человек); пациенты, находящиеся на лечении в ФГБНУ «ЦНИИТ» в период с 08.2021 по 02.2022 по поводу ТБ легких и перенесшие COVID-19 в срок до 3-х месяцев до момента включения в исследование (31 человек); пациенты, находящиеся на лечении в ФГБНУ «ЦНИИТ» в период с 08.2021 по 02.2022 по поводу ТБ легких и перенесшие COVID-19 в срок до 6 месяцев до момента включения в исследование (38 человек).

Всем больным с диагнозом ТБ легких назначали терапию с учетом лекарственной устойчивости M. tuberculosis и индивидуальной переносимости препаратов. Диагностику ТБ проводили у всех пациентов, включенных в исследование методом ВАСТЕС MGIT 960 (BD; США), согласно рекомендациям производителя [22]. Все образцы, давшие положительный результат, окрашивали по методу Циля–Нильсена, а затем проводили микроскопию для выявления кислотоустойчивых бактерий. В дальнейшем биоматериал исследовали методом ПЦР.

Все включенные в исследование пациенты перенесли COVID-19 легкой или среднетяжелой степени. Пациентов с тяжелой степенью COVID-19 в нашем исследовании не было.

Критерии исключения: возраст до 18 лет; беременность; наличие в анамнезе сахарного диабета, поливалентной аллергии, бронхиальной астмы, системного аутоиммунного заболевания, активного инфекционного процесса; декомпенсация хронической сердечной недостаточности; острый инфаркт; постоянный прием кортикостероидов.

В работе использовали образцы периферической крови пациентов и здоровых лиц, вошедших в исследование.

Определение Т-клеток, специфично отвечающих на антигены вируса SARS-CoV-2

У пациентов в день исследования получали 8 мл цельной венозной крови. В качестве антикоагулянта использовали гепарин-Na. Выделение мононуклеаров периферической крови проводили с использованием градиента фиколла плотностью 1,077 г/см³ («ПанЭко»; Россия). Определение числа Т-клеток, специфически отвечающих на антигены вируса SARS-CoV-2, проводили с использованием набора ТиграТест® SARS-CoV-2 («ГЕНЕРИУМ»; Россия) в соответствии с инструкцией фирмы-изготовителя. Подсчет точек, соответствующих CD4⁺/CD8⁺-Т-лимфоцитам, секретирующим IFNγ, производили на приборе S6 Ultra (CTL; США).

Определение IgG к антигену SARS-CoV-2

У каждого пациента, включенного в исследование, получали 5 мл цельной венозной крови. В дальнейшем для постановки ИФА использовали сыворотку крови. Полуколичественное определение IgG к антигену SARS-CoV-2 в сыворотке крови проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием набора SARS-CoV-2-IgGИФА (ФГБУ «НМИЦ гематологии» МЗ РФ) в соответствии с рекомендациями фирмы-изготовителя. Измерение оптической плотности проводили на планшетном ридере Sunrise^TM (TECAN; США).

Статистический анализ

Статистическую обработку проводили с помощью пакета статистических программ GraphPad Prism 8.4.3 (GraphPad Software; США) c использованием теста Манна–Уитни и χ²-тест.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Характеристика лиц, включенных в исследование

В исследование в качестве экспериментальных групп были включены 69 человек (33 женщины и 36 мужчин), находящиеся на лечении в ФГБНУ «ЦНИИТ» по поводу ТБ легких и перенесшие COVID-19 в срок до 3-х месяцев до момента включения в исследование (31 человек: 15 женщин и 16 мужчин; средний возраст 38 ± 15 лет) и до 6 месяцев до момента включения в исследование (38 человек: 18 женщин и 20 мужчин; средний возраст 39 ± 15 лет). Большинство пациентов были с инфильтративными ТБ-процессами (до 64%), до 28% — пациенты с деструктивными формами ТБ легких и 12,9% — пациенты с диссеминированными ТБ-процессами (рис. 1А–В). Всем больным назначали химиотерапию с учетом лекарственной устойчивости M. tuberculosis и индивидуальной переносимости. Бактериовыделение у пациентов с диагнозом ТБ, перенесших COVID-19 в срок до 3-х и 6 месяцев до момента включения в исследование, было отмечено в 58% и 47% случаев соответственно.

В качестве групп сравнения в исследование включили 35 человек (25 женщин и 10 мужчин), перенесших COVID-19 в срок до 3-х месяцев (16 человек: 14 женщин и 2 мужчины; средний возраст 48 ± 13 лет) и 6 месяцев (19 человек: 11 женщин и 8 мужчин; средний возраст 40 ± 14 лет) до момента включения в исследование, без ТБ в анамнезе.

В качестве негативного контроля в исследование были включены здоровые лица (15 человек (7 женщин и 8 мужчин; средний возраст 49 ± 14 лет)) без ТБ и COVID-19 в анамнезе.

Определение IgG к антигенам SARS-CoV-2-вируса

В первой части исследования мы сравнили наличие и титр IgG, специфичных к антигенам SARS-CoV-2-вируса у пациентов разных групп. Активный ТБ-процесс не влиял на наличие специфичных IgG в группах пациентов через 3 месяца после перенесенного COVID-19. Достоверных различий между данными группами не было выявлено (рис. 2).

Достоверные различия были показаны при сравнении наличия IgG к антигенам SARS-CoV-2-вируса в группах пациентов, перенесших COVID-19 за 6 месяцев до включения в исследование. Так же достоверно различался процент пациентов с положительным результатом теста на наличие IgG к антигенам вируса (рис. 2). Так, положительный результат теста на наличие антител к антигенам коронавируса был показан у 79% пациентов без активного ТБ, в то время как у больных с диагнозом ТБ легких только у 47,4% результат теста был положительный. У 12 пациентов с диагнозом ТБ легких (44,7%) через 6 месяцев после перенесенного COVID-19 IgG-антитела к антигенам SARS-CoV-2 не обнаружены (рис. 2).

Титр IgG к антигенам SARS-CoV-2-вируса различался как в группах пациентов без диагноза ТБ, так и у пациентов с диагнозом активный ТБ легких. Через 3 месяца после перенесенного COVID-19 выявлен максимальный титр антител к антигенам коронавируса как в группе пациентов с ТБ, так и без ТБ в анамнезе (рис. 3). Через 6 месяцев после коронавирусной инфекции титр IgG снижался, причем достоверно большее уменьшение титра IgG-антител наблюдали в группе пациентов с активным ТБ (рис. 3).

Таким образом, было показано, что наличие ТБ влияет на титр специфичных к SARS-CoV-2-вирусу IgG и длительность иммунологической памяти.

Оценка иммунологической памяти к антигенам SARS-CoV-2-вируса

Оценку иммунологической памяти к антигенам SARSCoV-2-вируса проводили с использованием набора ТиграТест® SARS-CoV-2. Данный набор позволяет определять количество Т-лимфоцитов CD4⁺/CD8⁺, которые отвечают на стимуляцию специфичными для SARS-CoV-2 антигенами, и позволяет подсчитать отдельные активированные Т-клетки. Результаты теста интерпретировали в соответствии с рекомендациями фирмы изготовителя. Было показано, что, как и в случае с антителами к антигенам коронавируса, наличие активного ТБ-процесса влияет на длительность иммунологической Т-клеточной памяти к SARS-CoV-2. Так, в группах лиц без ТБ процент пациентов с положительным результатом теста не менялся в срок 6 месяцев после перенесенного COVID-19 (рис. 4). В то время как у пациентов с активным ТБ легких процент лиц с положительным результатом теста снижался к 6 месяцам после вирусной инфекции. Были также получены достоверные различия в количестве пациентов с положительным результатом ТиграТест® SARS-CoV-2 в группах пациентов с активным ТБ и без ТБ в анамнезе через 6 месяцев после перенесенного COVID-19 (60,5% и 84,2% соответственно) (рис. 4).

Одним из антигенов ТиграТест® SARS-CoV-2 тестсистемы является S-белок SARS-CoV-2-вируса, что позволило нам изучить длительность иммунологической Т-клеточной памяти непосредственно к данному белку. При данном определении число пациентов с отрицательным результатом теста было больше, чем при стандартном определении наличия Т-клеток памяти к нескольким антигенам SARS-CoV-2-вируса (рис. 4–рис. 5) как в группе пациентов с активным ТБ, так и без ТБ в анамнезе. Было показано, что в группе пациентов с ТБ легких в 57,9% случаев не обнаруживаются Т-клетки памяти к S-белку SARS-CoV-2 через 6 месяцев после перенесенного вирусного заболевания, в то время как в группе пациентов без ТБ легких таких пациентов всего 21% (рис. 5).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Ранее была всесторонне исследована взаимосвязь между вирусом COVID-19 и ТБ, при этом основное внимание уделяли коинфекции и влиянию инфекции SARS-CoV-2 на латентный ТБ. В данном исследовании изучалось влияние ТБ на длительность иммунологической памяти на вирусные антигены. Наши результаты свидетельствуют о возможном снижении эффекторного ответа и усилении регуляторных механизмов иммунного ответа на антигены SARS-CoV-2 под влиянием бактериальной инфекции.

Данные двух крупных (> 1000 человек) исследований показали, что титры циркулирующих IgG к SARS-CoV-2 хорошо поддерживаются в течение 3–4 месяцев [19, 23]. Вирусспецифичные В-клетки памяти, антитела и Т-клетки памяти были обнаружены в случаях легкого протекания COVID-19 примерно через 90 дней после заражения [24].

При изучении взаимодействия с латентным ТБ (ЛТБИ) в одной из работ было проведено обследование серопозитивных, бессимптомных инфицированных SARSCoV-2 людей в Индии и сравнение иммунных реакций у IGRA-положительных (ЛТБИ) и негативных людей [25]. Авторы показали, что у IGRA-положительных людей были более высокие уровни гуморального, цитокинового и острофазового ответов по сравнению с IGRAотрицательными людьми, и, таким образом, пришли к выводу, что ЛТБИ может существенно влиять на системное воспаление, а также цитокиновый ответ и повышенную способность нейтрализующих антител у SARS-CoV-2- инфицированных людей.

Активное заболевание ТБ может негативно влиять на способность пациента генерировать SARS-CoV-2- специфический иммунный ответ, на основании анализа продукции IFNγ Т-клетками в когорте коинфицированных участников [26]. В цельной крови пациентов с ТБ/COVID-19 обнаружена самая низкая секреция IFNγ в ответ на стимуляцию пептидом SARS-CoV-2 по сравнению с пациентами с COVID-19 и пациентами с ЛТБИ/COVID-19. Авторы показали, что пациенты COVID-19 с латентным или активным ТБ все еще способны реагировать на Mtbспецифичные антигены. Однако только 20% больных активным ТБ с COVID-19 имели положительный ответ по сравнению с 64% пациентов с COVID-19 с ЛТБИ, что указывает на то, что активный ТБ угнетает COVID-19специфичный иммунный ответ хозяина [26], и подтверждает полученные ранее в работе [24] результаты в отношении COVID-19 с ТБ/ВИЧ [27].

Проведено обследование 119 человек и сравнение иммунного профиля плазмы крови 14 пациентов с коинфекцией ТБ/COVID-19, пациентов с коинфекцией COVID-19, пациентов с коинфекцией ТБ и 20 здоровых лиц из контрольной группы посредством 27-компонентного мультиплексного анализа [28]. Авторы обнаружили, что уровни циркулирующего TNF имеют наиболее сильную связь с коинфекцией ТБ/COVID-19 по сравнению с COVID-19. Они также показали, что у коинфицированных пациентов снижен SARS-CoV-2-специфичный ответ по ряду провоспалительных цитокинов и/или хемокинов, противовоспалительных цитокинов и факторов роста, а также (в меньшей степени) сделали вывод, что коинфекция негативно влияет на Mtb-специфичный ответ.

ВЫВОДЫ

В то время как в подавляющем количестве опубликованных исследований срок наблюдения за противовирусным иммунитетом у больных ТБ, перенесших COVID-19, ограничивался 3–4 месяцами [29], нами продемонстрировано снижение вирус-специфичного гуморального и клеточного иммунного ответа у пациентов с ТБ-коинфекцией через 6 месяцев после перенесенного COVID-19. Представленные нами данные указывают на сокращение длительности протективного антиковидного иммунитета под влиянием сопутствующей ТБ-инфекции. Очевидно, необходимы дальнейшие исследования, направленные на изучение долгосрочных последствий коинфекции SARS-CoV-2 и Mtb.