Полиамины представляют собой полимерные молекулы, содержащие несколько аминогрупп. Они участвуют в широком спектре биохимических процессов, таких как формирование мембранного потенциала, стабилизация ДНК и РНК, активация ферментов и транспорт ионов, а также участвуют в регуляции генной экспрессии, синтезе белков, оказывают антитоксическое действие, влияют на иммунную систему организма [1–2].

Поскольку полиамины образуются из аминокислот [3], их можно считать неотъемлемой частью метаболизма аминокислот и клеточной регуляции [4]. Уровни полиаминов могут регулироваться путем изменения биодоступности и концентрации аминокислот, необходимых для их синтеза [5]. Для того чтобы полиамины могли выполнять свои функции в различных клетках и тканях, они должны проникать через клеточные мембраны. Этот процесс включает в себя транспортные системы, в которых аминокислоты обеспечивают их перенос через мембраны. Следовательно, связь между полиаминами и аминокислотами охватывает не только биосинтез полиаминов, но и их влияние на клеточные процессы, включая регуляцию белков и взаимодействие с клеточными мембранами. Это комплексная область исследования, которая имеет большое значение для понимания физиологии и биохимии клеток.

Медицинское применение полиаминов все еще находится в стадии развития, но уже существует несколько направлений, в которых эти молекулы могут быть использованы в качестве биомаркеров для диагностики различных заболеваний: рака [6, 7], нейродегенеративных нарушений [8], инфекционных болезней и аутоиммунных расстройств [9].

В акушерстве полиамины связаны с различными аспектами беременности и родов [10], включая процессы клеточного роста и дифференцировки при развитии органов и систем плода [11–13]. Связь между аминокислотами и полиаминами имеет важное клиническое значение. Такая незаменимая аминокислота, как аргинин является предшественником полиаминов. Аргинин преобразуется в полиамин спермидин и спермин через серию биохимических реакций. Кадаверин тоже может синтезироваться из аргинина и участвовать в регуляции ряда клеточных процессов. Низкие уровни аргинина, лизина и аспарагиновой кислоты могут играть важную роль в процессах, приводящих к задержке роста плода (ЗРП). Аргинин, лизин и аспарагиновая кислота не только участвуют в синтезе белков, но и имеют важное значение для многих биохимических путей и функций организма [14]. Аргинин является предшественником оксида азота (II) (NO), который играет важную роль в регуляции сосудистой функции. NO расширяет сосуды и улучшает кровоток, а это ключевой фактор для обеспечения нормального роста и развития плода. Низкие уровни аргинина могут снизить производство NO и ухудшить сосудистую реакцию, что ограничит поступление питательных веществ к плоду [15]. Недостаток лизина может привести к снижению синтеза отдельных белков и повлиять на рост плода. Кроме того, лизин участвует в метаболизме жира и углеводов, и низкие уровни этой аминокислоты могут нарушить энергетическое обеспечение плода. Аспарагиновая кислота может влиять на метаболические пути других аминокислот, в том числе связанные с ростом и развитием плода.

Аминокислоты играют роль в регуляции артериального давления и функции сосудов. Исследования показывают, что изменения в аминокислотном профиле матери могут быть связаны с развитием преэклампсии (ПЭ). Например, высокие уровни глутаминовой и аспарагиновой кислот ассоциированы с риском развития преэклампсии [16] .

Определение уровней аминокислот и полиаминов в организме матери и плода может предоставить ценную информацию о риске развития ЗРП и ПЭ. Исследования продолжаются, и более глубокое понимание связи между аминокислотами, полиаминами и этими акушерскими состояниями может привести к разработке более эффективных методов диагностики и мониторинга беременностей, а также к улучшению стратегий лечения и профилактики.

Целью исследования было определить особенности уровней полиаминов и аминокислот, сопряженных с плацента-ассоциированными осложнениями беременности, в частности, при ЗРП (как изолированном, так и сочетанном с ранней ПЭ), а также выявить клинико-лабораторные параллели при ЗРП и ПЭ по данным корреляционного анализа связи уровня значимых полиаминов и аминокислот и таких клинических показателей, как тяжесть течения ЗРП и ПЭ, число койко-дней, проведенных в стационаре новорожденным, рожденным от матерей групп ПЭ и ЗРП.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

В исследование были включены 156 беременных, которые поступили и были родоразрешены в ФБГУ «НМИЦ АГП имени В. И. Кулакова» Минздрава России: группы ПЭ и ЗРП составили 56 и 48 пациенток c подтвержденными соответствующими диагнозами; в контрольную группу вошли 52 соматически здоровые женщины с беременностью без осложнений. Критерии включения в исследование: возраст беременных 18–35 лет, наличие одноплодной беременности на сроке 24–40 недель, ранняя преэклампсия и задержка роста плода. Критерии исключения: наличие резус- и AB0изоиммунизации, хромосомные аномалии, генетические мутации и врожденные пороки развития у плода, наличие у матери тяжелой экстрагенитальной патологии, хронических заболеваний почек, миомы матки больших размеров, острых инфекционных заболеваний. Для анализа была собрана венозная кровь.

Метод анализа полиаминов

Оптимизированная процедура приготовления образцов крови для анализа содержания полиаминов включает следующие этапы: к 400 мкл плазмы крови добавить 1200 мкл метанола, перемешивать 5 мин, центрифугировать 10 мин при 13 000 g (центрифуга Eppendorf MiniSpin, Германия), отобрать 1000 мкл надосадочной жидкости, высушить в токе азота при температуре 50 °C, добавить 600 мкл раствора дансилхлорида с концентрацией 10 мг/мл в ацетонитрил/карбонатном буферном растворе с pH = 9,7 (50/50 об./об.), перемешивать 1 мин, цетрифугировать 1 мин при 13 000 g, инкубировать при 60 °C в течение 90 мин, центрифугировать 1 мин при 13 000 g, добавить 1000 мкл этилацетата, перемешивать 10 мин, центрифугировать 10 мин при 13 000 g, отобрать 1000 мкл верхнего слоя, добавить 1000 мкл этилацетата, перемешивать 10 мин, центрифугировать 10 мин при скорости 13 000 g; отобрать 1000 мкл верхнего слоя и объединить с предыдущим отбором, высушить в токе азота при температуре 50 °C, добавить 200 мкл ацетонитрила, перемешивать 5 мин, центрифугировать 10 мин при 13 000 g; перенести 170 мкл для дальнейшего анализа.

Анализ полиаминов и аминокислот проводили с помощью жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (ЖХ-МС) на системе, состоящей из тройного квадрупольного масс-спектрометрического детектора ABSciex QTrap 5500 (ABSciex; Канада), оснащенного источником электрораспылительной ионизации, и жидкостного хроматографа Agilent 1260 Infinity (Agilent; США). Для разделения образца использовали колонку Agilent Zorbax Eclipse Plus C18 (50 × 3 мм, 1,8 мкм; Agilent, США). Для анализа органических кислот вводили

20 мкл образца и использовали в качестве элюента А

0,1%-й раствор муравьиной кислоты в воде; элюента В — 0,1%-й раствор муравьиной кислоты в ацетонитриле. Скорость потока 650 мкл/мин с поддерживаемой температурой колонки 30 °С. Состав подвижной фазы в ходе анализа изменялся следующим образом: 0–0,3 мин — 20% элюента В, до 5,3 мин объемная доля элюента B повышалась до 95%, сохраняла значение до 8,3 мин и за 0,1 мин возвращалась к значению 20%. Настройки массспектрометра были следующими: давление периферийного газа — 1,4 бар, давление газа-распылителя — 3,4 бар, температура источника — 500 °C, напряжение на капилляре — 4500 В.

В данной работе проводили анализ следующих девяти полиаминов: путресцин, этилендиамин, 1,3-диаминопропан, кадаверин, 1,7-диаминогептан, кадаверин, N-ацетилпутресцин, N1-ацетилспермин, спермидин; и 43 аминокислот: 1-метилгистидин, 3-аминоизобутират, 3-метилгистидин, аргининосукцинат, бета-аланин, креатинин, 5-гидроксилизин, гомоцистин, этаноламин, гамма-аминобутират, 2-аминоадипиновая кислота, 2-аминомасляная кислота, аланин, ансерин, аргинин, аспарагин, аспарагиновая кислота, карнозин, цитруллин, цистатионин, цистин, глутаминовая кислота, глутамин, глицин, гистидин, гомоцитруллин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, норвалин, орнитин, фенилаланин, пролин, серин, треонин, триптофан, тирозин, валин, О-фосфорилэтаноламин, саркозин, таурин, транс-4гидроксипролин.

Статистический анализ

Статистическую обработку полученных экспериментальных данных проводили с помощью скриптов, написанных на языке R.

Статистический анализ проводили с помощью непараметрического критерия Манна–Уитни. Для описания количественных данных использовали медианы (Me) и квартили Q₁ и Q₃ в формате Me (Q₁; Q₃), а также средние значения (M) и среднеквадратическое отклонение (SD) в формате M ± SD. Величину порогового уровня значимости p принимали равной 0,05. Если значение p было меньше 0,001, то его указывали в формате p < 0,001.

Поиск клинико-лабораторных параллелей при ЗРП и ПЭ проводили с помощью корреляционного теста Спирмена для уровней полиаминов, аминокислот и клинических показателей. Статистически значимой признавали связь с p < 0,05.

Для оценки возможности классификации пациентов по группам на основании исследуемых параметров были разработаны модели логистической регрессии. Из всех разработанных моделей выбирали четыре с наибольшей величиной площади под ROC-кривой (AUC). Качество разработанных моделей определяли путем построения ROC-кривой, определения площади под ROC-кривой, а также расчета чувствительности и специфичности.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В исследование дизайна «случай–контроль» беременных пациенток включали по мере обращения после постановки им диагноза ЗРП или ПЭ. На момент включения в исследование и сбора крови пациентки группы ПЭ имели ее умеренную тяжесть со стабильными показателями артериального давления, незначительную протеинурию при нормальных показателях суточного диуреза, отсутствие нарушений со стороны плода по данным допплерометрии (фето-плацентарный кровоток и дистресс плода); пациентки группы ЗРП (3-й процентиль и менее по данным фетометрии) не имели допплерометрических признаков дистресса плода. У всех пациенток не было регулярной родовой деятельности или угрозы преждевременных родов. На момент родоразрешения, которое в среднем происходило через три недели после забора крови, треть пациенток имели диагноз тяжелая преэклампсия и у более половины от всех были выявлены критические нарушения плодово-плацентарного кровотока, что и послужило показанием к проведению экстренного оперативного родоразрешения путем операции кесарева сечения. У пациенток контрольной группы забор крови проводили в сроки беременности, сопоставимые со сроками у пациенток с ПЭ и ЗРП. В последующем течение их беременности и родоразрешение были отслежены и не отягощены.

Учитывая, что старший репродуктивный возраст и ожирение могли стать серьезными конфаундерными факторами при оценке уровней аминокислот и полиаминов в крови, группы составляли таким образом, чтобы возраст и вес пациенток с ПЭ были сопоставимы с группой контроля. Индекс массы тела (ИМТ) беременных женщин из группы ЗРП был значимо ниже, чем у женщин групп «норма» и «преэклампсия» (p = 0,005 и p = 0,003 соответственно).

Результаты анализа клинических параметров исследуемых групп представлены в табл. 1.

Из-за необходимости ускоренного родоразрешения по акушерским показаниям, в связи с нарастанием тяжести ПЭ и прогрессирующей внутриутробной гипоксии плода при ЗРП, срок родоразрешения для данных групп статистически значимо отличался от контрольной группы (p < 0,001). Для случаев ПЭ и ЗРП средний вес новорожденных составил 2132,0 г и 1969,7 г.

Следует отметить, что оценка новорожденного по шкале Апгар в группе с ПЭ была значимо ниже на первой минуте жизни (p < 0,001), тогда как на пятой минуте балл по шкале Апгар значимо отличался во всех группах, что, вероятно, связано с нарушением адаптации в раннем неонатальном периоде у новорожденных из групп ПЭ и ЗРП, длительно пребывающих в условиях хронической гипоксии.

Из-за важной роли аминокислот в синтезе полиаминов и их функции в клеточном метаболизме на первом этапе лабораторного анализа данных был проведен анализ уровня аминокислот среди пациенток исследуемых групп.

Анализ данных позволил выявить снижение в случаях ПЭ и ЗРП по сравнению с контрольной группой уровня ряда аминокислот: при ЗРП значимо снижались  аргинин (p = 0,0136), орнитин (p = 0,045), пролин (p = 0,0044), при ПЭ — аспарагиновая кислота (p = 0,0422) (рис. 1). Низкие уровни (отн. ед.) при  ЗРП аргинина — 0,0163 (0,0139, 0,0182) и лизина 0,0524 (0,0492, 0,056) могут играть важную роль при синдроме ЗРП.

Далее был получен уровень полиаминов в сыворотке крови пациенток исследуемых групп. Для группы пациенток с ПЭ выявлены значимые отличия от контрольной группы для путресцина (p = 0,0423) и спермидина (p = 0,022), для группы ЗРП — кадаверина (p = 0,0282). При сравнении данных для групп ПЭ и ЗРП значимые отличия выявлены для двух полиаминов: путресцин (p = 0,0039) и 1,7-диаминогептан (p = 0,0091) (рис. 2).

В организме человека путресцин образуется из L-орнитина при участии фермента орнитиндекарбоксилазы (ОДК). Спермидин синтезируется из путресцина с участием двух ферментов: спермидинсинтазы и сперминсинтазы. Данные ферменты самые короткоживущие в организме человека (время полураспада 5–10 мин), что указывает на их прямую роль в биосинтезе белка. Косвенно оценить активность этих ферментов можно исходя из отношения уровня спермидина к путресцину (активность спермидинсинтазы) и отношения спермина к спермидину (активность сперминсинтазы) (рис. 3).

Отношение спермидина к путресцину в группе «норма» (–0,33 (–0,43; 0,05)), в группе пациенток с ПЭ (–0,21 (–0,29; 0,25)) и в группе пациенток с ЗРП (–0,34 (–0.44; –0,13)); а отношения спермина к спермидину в данных группах составили:  0,07 (–0,38; 0,57); –0,48 (–0,64; –0,08); –0,33 (–0,65; 0,52) соответственно.

Полиамины активно вовлечены в клеточные механизмы неспецифических стресс–реакций (полиаминный стрессответ). При травмирующем воздействии на организм, например при ишемии/гипоксии нервной ткани, в мозге активируется ОДК с последующим увеличением содержания полиаминов и запуском активации генов раннего ответа (c-myc, c-fos и др.) [17].

С учетом биологической значимости полученных результатов особый интерес представлял поиск клинико-лабораторных параллелей при ЗРП и ПЭ. Для этого был выполнен корреляционный анализ связи уровня значимых полиаминов и аминокислот и таких клинических показателей, как тяжесть течения ЗРП и ПЭ, число койкодней, проведенных в стационаре новорожденными, рожденными от матерей групп ПЭ и ЗРП (табл. 2).

В табл. 2 представлены статистически значимые связи между клиническими параметрами и уровнями аминокислот плазмы крови. Для уровня транс-4-гидроксипролина плазмы была зафиксирована статистически значимая обратная связь с декомпенсацией состояния плода при ЗРП, а также статистически значимая прямая связь с весом ребенка при рождении. Аналогично, уровень пролина статистически значимо прямо пропорционален весу ребенка и обратно — декомпенсации состояния плода при ЗРП. Была также зафиксирована прямая связь уровня глутамина с тяжестью преэклампсии, обратная связь с уровнем аспарагиновой кислоты и числом койкодней в стационаре. 

Аналогичный анализ провели для полиаминов (табл. 2). При ЗРП обнаружена корреляционная связь с тяжестью течения данного осложнения и уровнями 1,7-диаминогептана и кадаверина. Уровень путресцина коррелировал с тяжестью ПЭ. Число койко-дней, проведенных в стационаре новорожденным, для групп ПЭ и ЗРП коррелировало с уровнем 1,7-диаминогептана.

Интерес представляют выявленные связи с пролином и 1,7-диаминогептаном. Эти метаболиты имеют среднюю и сильную корреляцию с клиническими данными, характеризующими акушерские исходы: вес ребенка при рождении и число койко-дней в стационаре, соответственно, что позволяет рассматривать их в качестве прогностических маркеров динамической оценки нарастания тяжести ЗРП и ранней ПЭ.

С целью первичной оценки прогностических и диагностических (оценка тяжести состояния плода) возможностей описанных метаболитов для выявления тяжести течения ПЭ и ЗРП и оптимизации акушерской тактики ведения данной когорты беременных построены математические модели. Высокой чувствительностью и специфичностью обладали четыре модели, включающие проанализированные в ходе работы полиамины (рис. 4).

В модели логистической регрессии в качестве независимой переменной выступали уровни полиаминов в плазме крови, в качестве зависимой переменной — принадлежность образца к группе ПЭ или ЗРП. Площадь под операционной кривой для модели составила 0,865, чувствительность и специфичность — 0,95 и 0,76 соответственно. Пороговые значения для разработанных моделей были равны 0,45, 0,3, 0,24 и 0,26.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Аминокислоты являются основными строительными блоками белков, которые играют важную роль в росте и развитии плода. Аргинин, лизин и аспарагиновая кислота не только участвуют в синтезе белков, но и имеют важное значение для многих биохимических путей и функций организма. Пролин выполняет важную функцию в составе основного белка соединительной ткани — коллагена. Известно его влияние на развитие плаценты и плода за счет усиления плацентарного транспорта питательных веществ, ангиогенеза и синтеза белка [18]. Снижение уровня пролина в крови беременных с ЗРП и ранней ПЭ, имеющее прямую кореляционную связь с весом новорожденного, указывает на его возможную роль в патогенезе данных осложнений беременности. Коллаген является важным тканевым компонентом плацентарного комплекса и нарушение его структуры на этапах биосинтеза, секреции или сборки, вызванное снижением уровня пролина, вероятно может быть одним из существующих патологических механизмов реализации плацентарной недостаточности. Есть сообщение о снижении концентрации цервикального гидроксипролина у небеременных женщин с истмикоцервикальной недостаточностью в анамнезе [19].

Кроме аминокислот, входящих в состав белков, в организме имеется постоянный резерв свободных аминокислот, содержащихся в тканях и различных биологических жидкостях, которые находятся в динамическом равновесии. В течение беременности свободные аминокислоты могут служить индукторами синтеза стероидных гормонов, участвовать в процессе биосинтеза гликопротеинов, порфиринов, нейромедиаторов, полиаминов и оксида азота.

Метаболизм ряда аминокислот ведет к синтезу регуляторных полиаминов. Полиамины так же присутствуют в различных биологических жидкостях: крови, моче, ликворе и др. В крови содержание свободных полиаминов ниже, чем в тканях или в моче. Однако определение полиаминов именно в крови беременных в качестве маркера тяжести таких осложнений, как ПЭ и ЗРП, представляет интерес для практической медицины.

Изучение уровня свободных аминокислот и полиаминов может быть важным для понимания молекулярных процессов во время беременности [20].

Полученные нами данные демонстрируют значимую связь изменения уровня полиаминов в крови и плацентаассоциированных осложнений беременности. Для таких полиаминов, как спермидин, путресцин, кадаверин и 1,7-диаминогептан, наблюдалось значимое изменение уровня в группах, представленных беременными с плацента-ассоциированными осложнениями. При ЗРП концентрация 1,7-диаминогептана была статистически значимо повышена, на фоне снижения при ПЭ. Особый интерес вызывает то, что данное наблюдение среди пациенток с ЗРП было описано нами ранее в публикации, посвященной диагностическому потенциалу полиаминов мочи [21]. Результаты наших исследований перекликаются с работой китайских ученых, которые рассматривали влияние N1-гуанил-1,7-диаминогептана (GC7), мощного ингибитора дезоксигипузинсинтазы, на пролиферацию, дифференцировку и апоптоз эндотелиальных клеток [22]. Участие диаминогептанов в экспрессии белков клеточной пролиферации и апоптозе эндотелиальных клеток, указывает на возможность потенциального использования данного биомаркера для диагностики плацента-ассоциированных осложнений беременности и прогнозирования их тяжести. Повышение концентрации 1,7-диаминогептана в крови при ЗРП может косвенно указывать на дозозависимое ингибирование клеточной пролиферации, быть биомаркером ЗРП и изменяться в зависимости от нарастания тяжести состояния плода.

Учитывая многообразие и сложность метаболических путей, ответственных за адаптацию в условиях гипоксического поражения, следует ожидать, что их регуляция является координированной. Для изучения такого типа регуляции особый интерес могут представлять пути метаболизма низкомолекулярных антиоксидантов — пролина и полиаминов.

В норме гомеостаз пролина и полиаминов поддерживается сбалансированной системой их биосинтеза и деградации. Чаще всего общим предшественником в их биосинтезе является глутамат, который служит более отдаленным предшественником, превращающимся сначала в орнитин или аргинин. Образовавшиеся аминокислоты являются прямыми субстратами двух ферментов (орнитиндекарбоксилазы или аргининдекарбоксилазы), катализирующих биосинтез путресцина — предшественника более длинных полиаминов (спермидина и спермина). Несмотря на установленную связь путей синтеза пролина и полиаминов, вопрос о возможности координированной регуляции метаболизма этих низкомолекулярных соединений, особенно в стрессорных условиях, остается дискуссионным.

Интерес представлял анализ профиля свободных аминокислот крови при плацента-ассоциированных осложнениях беременности. По некоторым данным, уровни L-аргинина, L-пролина и L-орнитина могут отображать перинатальное поражение центральной нервной системы у новорожденных с внутриутробной задержкой роста [23]. Значимые корреляционные связи для ряда клинических параметров (декомпенсация состояния плода при ЗРП, тяжесть ПЭ, вес при рождении, число койко-дней в стационаре и отделении патологии новорожденных) и таких аминокислот, как пролин и транс4-гидроксипролин, глутамин и аспарагиновая кислота, указывает на задействованность данных метаболитов в процессах синтеза белка, поддержании структуры рибосом и образования коллагена при ЗРП, как изолированной форме, так и сочетанной с ранней ПЭ.

Принимая во внимание, что данные были собраны на начальных клинических проявлениях акушерских синдромов, возможный потенциал полиаминов для определения прогноза течения ПЭ и ЗРП и сроков родоразрешения невероятно высок. Большой интерес представляет разработка методов диагностики и мониторинга уровня полиаминов у беременных женщин. Такие методы могут служить инструментами для прогнозирования риска акушерских синдромов и открывают окно возможностей для дальнейшего их применения после проведения углубленной валидации и динамического контроля в зависимости от течения ЗРП и ранней ПЭ во времени.

ВЫВОДЫ

Изучение роли полиаминов и их связи с уровнем свободных аминокислот в крови способствует разработке методов диагностики и предикции акушерских синдромов, что является важной областью исследований, которая может привести к появлению новых подходов в обследовании и лечении беременных женщин, а также улучшить заботу о здоровье матери и ребенка в период беременности.