Фиброз является одним из возможных вариантов восстановления раневых дефектов слизистой оболочки полости рта [1]. Однако его наличие ведет к уменьшению объема мягких тканей, отрицательно сказывается на архитектонике поврежденной области и негативно влияет на дальнейшее стоматологическое лечение [2].

Еще на ранних стадиях регенерации раневых дефектов можно выделить ряд предикторов, анализ выраженности которых может спрогнозировать риск возникновения фиброза. Отмечается, что взаимоотношения клеток макрофагального и фибробластического ряда меняются в зависимости от стадии раневого процесса и вероятности риска возникновения фиброзных изменений [3].

Отражением развития фиброза является также выделение клеточными популяциями в области раневого дефекта трансформирующего фактора роста (TGFβ). Он высвобождается фибробластами, макрофагами, а также другими клетками раневого ложа, на фоне повышения его экспрессии стимулируется образование грануляционной ткани, синтез коллагена и ангиогенез [4]. Однако выраженность его экспрессии и влияние на развитие плотной волокнистой соединительной ткани сильно зависит от микроокружения и клеточного контекста. TGFβ либо стимулирует, либо ингибирует пролиферацию клеток. Он действует как хемоаттрактант для моноцитов и фибробластов, и его выраженная экспрессия во время первой стадии регенерации раны способствует развитию грануляционной ткани. Однако на завершающем этапе репарации повышенная экспрессия TGFβ сопровождается выраженной клеточной инфильтрацией и снижением коллагенолиза [5]. Маркер активности макрофагов CD68 также может быть исследован для прогнозирования варианта заживления ран [6].

На основании анализа перечисленных показателей можно исследовать эффективность использования различных биосовместимых материалов для закрытия раневых дефектов.

В литературе отсутствуют сведения об изучении эффективности использования раневых покрытий со схожими физико-химическими свойствами для регенерации раневых дефектов слизистой оболочки полости рта.

Цель данного исследования — провести морфологическую оценку влияния биосовместимых пьезоэлектрических мембран на формирование фиброзной ткани в процессе регенерации ран слизистой оболочки полости рта.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эксперимент представлял собой простое сравнительное исследование двух подходов при лечении раневых дефектов слизистой оболочки полости рта — с закрытием дефекта биосовместимым покрытием и без него.

Исследуемая в данной работе полимерная пьезоэлектрическая мембрана представляет собой нетканое полотно из сополимера винилиденфторида с тетрафторэтиленом, изготовленное при помощи электроспиннинга. Мембрана состоит из двух слоев — гидрофильного, обращенного в сторону раневого дефекта, и гидрофобного наружного. Мембрана не является биодеградируемой, по завершении процесса регенерации она извлекается с поверхности зажившего раневого дефекта.  Ранее проведенные исследования показали, что наличие пьезоэлектрических свойств у мембран по сравнению с диэлектрическими мембранами способствует ускоренному образованию рыхлой волокнистой соединительной ткани с более низким показателем удельной площади плотной волокнистой соединительной ткани. Также было проведено исследование покрытий на биосовместимость и цитотоксичность при помощи фибробластов 3T3L1 лабораторией биополимеров и биотехнологий Томского государственного университета [7].

Всего в исследовании использовали 45 крыс линии Wistar (четырехмесячных самцов массой 350 ± 30 г), по 15 животных в каждой группе. К 1-й группе (n = 15) относились животные с открытым раневым дефектом, ко 2-й (n = 15) — животные с раневым дефектом, перекрытым полимерной пьезоэлектрической мембраной, к 3-й (n = 15) — животные с интактной слизистой оболочкой. Животных распределяли по группам при помощи метода блочной рандомизации. Животные были предоставлены НИИ фармакологии и регенеративной медицины имени Е. Д. Гольдберга (Томск, Россия). Эксперимент проводили после двухнедельного периода акклиматизации животных. Всех крыс содержали в стандартных условиях вивария: в отдельных подписанных клетках по пять особей в каждой с постоянным доступом к еде и воде начиная со вторых суток исследования при температуре от +12 до +18 °С по Цельсию [8].

Выбор в качестве объектов исследования этого вида животных был обусловлен рядом факторов: высокой степенью трансляции данных экспериментального моделирования по отношению к человеку, генетической однородностью (гомозиготностью), определяющей постоянство реакции на воздействие физико-химических, физиологических, биопатогенных и стрессовых факторов, известный уровень чувствительности к раздражителям; специфичностью и выраженностью биохимических, иммунологических, функциональных и морфологических показателей [9].

Для имитации раневого дефекта слизистой оболочки полости рта животным иссекался лоскут слизистой оболочки размером 7 × 4 мм из области щеки. После этого животным 2-й группы при помощи узловых швов фиксировали мембрану по краям раны. Все хирургические манипуляции над животными производили после введения их в состояние наркоза при помощи препарата «Золетил 100» в дозировке 10 мг/кг (Вирбак, Каррос; Франция). Критерии исключения животных из исследования с последующей эвтаназией — ухудшение их общего состояния, характеризующееся вялостью, апатией, отказом от еды, нарушениями сна или преждевременной смертью животного. Ни одно животное не было исключено из исследования.

Животных выводили из исследования на 3-е, 7-е и 12-е сутки (по пять особей для каждой группы) путем введения в состояние гипоксии в СО₂-камере.

Образцы тканей для гистологического исследования брали из области раневого дефекта, захватывая по 1 мм ткани с периферии. Полученные при аутопсии ткани фиксировали в 10%-м растворе нейтрального формалина («Биовитрум»; Россия), промывали под проточной водой, обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации и изопропаноле («Биовитрум»; Россия) и заливали парафином («Биовитрум»; Россия). Изготавливали гистологические срезы толщиной 5 мкм при помощи санного микротома МС-1 (Орион-Медик, Россия). Срезы окрашивали гематоксилином и эозином («АБРИС+»; Россия) и пиркофуксином Ван Гизона («Биовитрум»; Россия). Полутонкие срезы окрашивали толуидиновым синим.

Проводили качественную и количественную гистологическую оценку удельной площади волокнистой соединительной ткани, численной плотности макрофагов и фибробластов в 1 мм² среза. Гистологические срезы исследовали с помощью светопольного микроскопа Axioskop 40 (Carl Zeiss AG; Германия) с объективом ×40 и ×90, окулярами ×10). Изучали по 50 полей зрения из области раневого дефекта в каждой группе.

Иммуногистохимическое окрашивание производили при помощи кроличьих рекомбинантных поликлональных антител CD68 и TGFβ I изотипа IgG (Abcam; США). Отмечали интенсивность иммуногистохимической окраски по McCarthy [10]: 0 — отсутствие окрашивания, 1 — слабое окрашивание, 2 — умеренное окрашивание, 3 — сильное, 4 — очень сильное окрашивание. Формула подсчета:

Histochemical scores = ∑ P(i) × i,

где i — интенсивность окрашивания, выраженная в баллах от 0–4,

P(i) — процент клеток, окрашенных с разной интенсивностью.

Подсчет проводили в трех когортах по 100 клеток в различных полях зрения (объектив ×40, ×90).

Обработку изображений выполняли с использованием программы Axio Vision 4.8.2 (Carl Zeiss AG; Германия) и ImageJ v.1.54u (Национальный институт здравоохранения, Мэриленд).

Для оценки ультраструктуры макрофагов и фибробластов изготавливали препараты для электронной микроскопии по стандартной методике: фиксировали ткани в 2,5%-м растворе глутарового альдегида и какодилатном буфере (0,2 М; 1 : 9), постфиксировали в 1%-м растворе тетраоксида осмия, осуществляли дегидратацию и заливку в смесь аралдита М и эпона. Использовали ультратом LKB-5 (BROMMA; Швеция) для изготовления срезов, контрастировали препараты уранил-ацетатом и цитратом свинца. Изучали ультраструктуру, используя электронный микроскоп JEOL JEM -1400 CX (Jeol; Япония).

Статистическая обработка

Для анализов in vivo использовали программное обеспечение Statistica версии 10.0 (StatSoft Inc.; США). Проводили проверку статистической гипотезы распределения признаков с использованием теста Колмогорова–Смирнова. Все результаты представлены как медиана и квартили, М (Q₁; Q₃). Непараметрический критерий Краскела–Уоллиса с медианным тестом использовали для сравнения независимых выборок, для парных сравнений применяли критерий Уилкоксона. Различия считали статистически значимыми при р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

На 3-и сутки исследования в экспериментальных группах в области раневого дефекта наблюдалась грануляционная ткань, в группе с покрытием встречались отдельные пучки соединительнотканных волокон. В области раневого дефекта визуализировалась клеточная инфильтрация, представленная, в основном, нейтрофилами. Кроме того, определялись макрофаги и фибробласты, при этом в группе с покрытием они визуализировались чаще (рис. 1A). Так, численная плотность фибробластов в группе с раневым покрытием была в 1,4 раза значимо больше (р = 0,035), чем в группе без него и в 14 раз достоверно больше (р = 0,012) чем в интактной слизистой оболочке (см. таблицу). На основании ультрамикроскопического исследования можно отметить, что визуализировались преимущественно небольшие юные фибробласты с умеренно развитыми органеллами синтеза. Макрофагальная инфильтрация также была более выражена в группе с мембраной, численная плотность данной клеточной популяции в ней была в 2,3 и 10,7 раз достоверно больше, чем в группе с открытым раневым дефектом и группе контроля соответственно (р = 0,034, р = 0,018). На ультрамикроскопическом уровне макрофаги обладали признаками высокой фагоцитарной и синтетической активности, что отражалось на уровне экспрессии маркера CD68, которая значимо повышалась в 2,6 и 4,2 раз для группы без покрытия и группы с мембраной соответственно по сравнению со значениями в интактной слизистой оболочке (р = 0,022, р = 0,031). Более выраженная экспрессия маркера TGFβ1 наблюдалась в группе с открытым раневым дефектом: показатель H-score в ней был в 1,4 раза достоверно больше (р = 0,045), чем в группе с мембраной и в 6,3 раза достоверно больше, чем в интактной слизистой оболочке (р = 0,022) (см. таблицу) (рис. 1Б).

На 7-е сутки исследования в экспериментальных группах визуализировалась сформированная рыхлая волокнистая соединительная ткань, между волокнами которой определялись скопления макрофагов и фибробластов (рис. 1В). На этом этапе регенерации раны во всех полях зрения преимущественно встречались макрофаги и фибробласты. Численная плотность первых была максимальной в группе без покрытия и достоверно превышала в 1,6 и 11,3 раз аналогичный показатель группы с полимерной мембраной и контрольной группы (р = 0,019, р = 0,011) (см. таблицу). Это соотносилось с экспрессией маркера CD68, для которого показатель H-score в группе без покрытия был в 1,2 и 6,5 раз значимо выше, чем в группе с покрытием и интактной слизистой оболочкой (р = 0,048, р = 0,024). При этом численная плотность фибробластов наоборот была максимальной в группе с мембраной и была достоверно выше в 1,35 раза таковой в группе без нее (р = 0,041) (см. таблицу). В группе без покрытия по-прежнему преобладали юные фибробласты, а в группе с использованием мембраны, в основном, визуализировались дифференцированные зрелые фибробласты с ультраструктурными признаками повышенной синтетической активности (рис. 1Г). Реакции на инородное тело в области имплантации мембраны не наблюдалось ни на одном из этапов эксперимента. Экспрессия маркера TGFβ1 была значимо выше в группе с открытым раневым дефектом в 2,8 раз по сравнению с группой с мембраной (р = 0,036) и в 8 раз по сравнению с группой контроля (р = 0,013).

На 12-е сутки исследования в группе без раневого покрытия встречались обширные очаги плотной волокнистой соединительной ткани (рис. 1Д). Ее удельная площадь была в 3,9 раз достоверно выше, чем в группе с покрытием (р = 0,036). Отражением этого процесса на макроскопическом уровне являлась деформация щечной области с убылью мягких тканей, на месте раневого дефекта определялся рубец протяженностью 4,5 мм (рис. 1Е).  В группе с полимерной мембраной длина рубца достигала 1,5 мм, деформация мягких тканей была не выражена. В группе с мембраной численная плотность макрофагов и фибробластов достигала контрольных значений. В группе без раневого покрытия эти показатели были в 6 и в 7,2 раза достоверно выше интактных значений (р = 0,032, р = 0,021). В группе без раневого покрытия фибробласты сохраняли ультраструктурные признаки высокой синтетической активности, в то время как в группе с покрытием преобладали функционально неактивные фиброциты (рис. 1Ж). У макрофагов на ультраструктурном уровне визуализировались хорошо развитые гранулярный эндоплазматический ретикулум, аппарат Гольджи и митохондрии, что свидетельствовало о высокой синтетической активности. Экспрессия CD68 и TGFβ1 была значимо выше в группе с открытым раневым дефектом, чем в группе с покрытием и интактной слизистой оболочкой в 2 и 3 раза соответственно (р = 0,019, р = 0,025) (см. таблицу) (рис. 1З).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В ходе проведения данного исследования были проанализированы основные предикторы развития фиброзной ткани в области раневого дефекта слизистой оболочки полости рта. На основании результатов исследования, а также анализа литературы можно сформировать следующую схему патоморфогенеза (рис. 2).

Согласно схеме, на первом этапе регенерации раневого дефекта, в фазу воспаления, наблюдалась обширная клеточная инфильтрация в области заживления. В группе с использованием биосовместимой мембраны было выявлено значительное скопление макрофагов, чья численная плотность была значимо выше, чем в группе с открытым раневым дефектом. С этим показателем соотносилась увеличенная экспрессия маркера макрофагов CD68 в группе с полимерной мембраной. На ультрамикроскопическом уровне можно было отметить признаки усиленной синтетической активности макрофагов в группе с покрытием. Развитый синтетический аппарат был необходим для выделения биологически активных веществ, которые в том числе являлись аттрактантами для миграции фибробластов в зону ранения [11]. Полученные данные мы интерпретировали как факт перехода воспалительной стадии в пролиферативную, так как именно макрофаги отвечают за процесс направленной миграции фибробластов за счет высвобождения фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), тромбоцитарного фактора роста (PDGF) и TGFβ, способствующих ангиогенезу, выработке коллагена и реэпитализации [12].

Также в группе с покрытием значимо увеличивалась численная плотность клеток фибробластического ряда. Это тоже свидетельствовало о том, что в группе с раневым покрытием основные процессы, происходящие в ране, переключались с воспалительной реакции на формирование соединительной ткани.

Однако для правильной интерпретации данных показателей необходим был их анализ в динамике, так как сохранение обширной инфильтрации, особенно макрофагами, на дальнейших этапах регенерации раны могло быть предпосылкой к развитию фиброза. Именно это мы и наблюдали в группе без раневого покрытия, где численная плотность макрофагов была значимо выше на 7-е сутки исследования, чем в группе с раневым покрытием, и не достигала контрольных значений на 12-е сутки исследования. Численная плотность фибробластов, наоборот, на 7-е сутки исследования была достоверно ниже в группе без покрытия.  На 12-е сутки численная плотность фибробластов повышалась по сравнению с интактной слизистой оболочкой и группой с покрытием. Подобное взаимоотношение макрофагов и фибробластов в группе с открытой раной свидетельствовало о длительно текущем воспалительном процессе, который способствовал развитию фиброза в дальнейшем [11]. В группе с использованием биосовместимой пьезоэлектрической мембраны, численная плотность рассматриваемых клеточных популяций восстанавливалась до контрольных значений на 12-е сутки исследования, что являлось положительным прогностическим признаком.

Выделение клетками TGFβ1 служит первоначальным триггером для начала регенерации раны, в связи с этим мы наблюдали увеличение его экспрессии на 3-и сутки исследования в обеих экспериментальных группах [12]. Однако его экспрессия была значимо больше в группе без раневого покрытия, чем в группе с биосовместимой мембраной, и достигала своего максимума на 7-е сутки исследования и не возвращалась к контрольным значениям на 12-е сутки исследования. Данный маркер выделяется рядом клеток в области раневого дефекта — тромбоцитами, макрофагами, фибробластами, кератиноцитами и др. [4]. И именно он имеет критически важную роль в ходе смены стадий регенерации, оказывая влияние на кооперацию макрофагов и фибробластов в области раны [5]. При этом отмечается, что не только разные типы клеток по-разному реагируют на TGFβ1, но и одни и те же клетки могут проявлять противоположные ответы в зависимости от экспериментальных условий [5].

Зафиксированное на 7-е сутки исследования повышение экспрессии TGFβ1 опосредовало сохранение обширной инфильтрации в области раны синтетически активными фибробластами и макрофагами на 12-е сутки исследования в группе с открытым раневым дефектом. В то время как их численная плотность в группе с покрытием возвращалась к контрольным значениям на финальном этапе регенерации раны на фоне более низких значений H-score для TGFβ1. К тому же клетки фибробластического ряда были представлены в основном синтетически неактивными фиброцитами, что свидетельствовало о завершении процесса формирования соединительной ткани в области раневого дефекта в группе с полимерной мембраной. В группе с открытым раневым дефектом на 12-е сутки исследования в области раны присутствовали, в основном, синтетически активные фибробласты. Под действием TGFβ1 фибробласты подвергались пролиферации, миграции и дифференцировке, а на фоне аберрантной передачи сигнала от TGFβ1 активировался механизм образования рубцовой ткани [12]. Формирование рубцовой ткани было связано с патологическим и дезорганизованным процессом заживления раны при хроническом воспалении [13], которое возникало на фоне повышения уровня экспрессии TGFβ1, что являлось важным этапом патогенеза хронических ран [14]. Таким образом, повышение экспрессии TGFβ1 можно считать важным профиброзным маркером [15].

Поэтому в группе с открытым раневым дефектом в ходе взаимодействия между фибробластами и макрофагами под воздействием TGFβ1 формировалась плотная волокнистая соединительная ткань, которая была основой фиброзных изменений, что на макроскопическом уровне проявлялось наличием рубца длиной 4,5 мм и убылью мягких тканей.

Полимерные пьезоэлектрические мембраны из сополимера винилиденфторида с тетрафторэтиленом, изготовленные при помощи электроспиннинга, являются новейшей разработкой лаборатории гибридных биоматериалов НИ ТПУ. Ранее в мировой практике не проводились исследования относительно эффективности использования аналогов, схожих по физико-химическим свойствам, для регенерации раневых дефектов слизистой оболочки полости рта. На основании этой работы мы предполагаем, что пьезоэлектрические свойства биосовместимых полимерных мембран способствовали снижению экспрессии TGFβ1, что приводило к ингибированию его влияния на активность фибробластов и макрофагов. Благодаря этому происходило формирование рыхлой волокнистой соединительной ткани, в то время как в группе с открытой раной происходило образование плотной волокнистой ткани и, как следствие, рубцевание. Подтверждением данного предположения являются данные, полученные при сравнительном исследовании пьезоэлектрических и диэлектрических покрытий при регенерации ран слизистой оболочки полости рта, в ходе которого была зафиксирована меньшая удельная площадь рубцовой ткани в группе с пьезоэлектрическим покрытием [7].

ВЫВОДЫ

В проведенном исследовании выявлено положительное влияние биосовместимых пьезоэлектрических мембран на предупреждение развития фиброза в процессе регенерации ран, что было подтверждено анализом взаимодействия клеток макрофагального и фибробластического ряда и экспрессии прогностических маркеров CD68 и TGFβ 1. Использование полимерных биосовместимых мембран в стоматологической практике поможет в перспективе снизить риск возникновения постоперационных осложнений в виде рубцовой деформации мягких тканей ротовой полости. В перспективе планируется дальнейшее изучение влияния покровных мембран на регенерацию слизистой оболочки полости рта для усовершенствования их свойств.