Одним из приоритетных и перспективных направлений в современной биологии, а также экспериментальной и клинической медицине является оптимизация методов криоконсервации биоматериалов с возможностью пролонгированного сохранения их функциональных и фенотипических особенностей. При этом способы криоконсервации биоматериала должны обладать низкой токсичностью и поддерживать клеточные механизмы гомеостаза. Существенное замедление метаболизма в клетке начинается при температуре –70 °С, поэтому применяют консервирование с использованием жидкого азота, но это требует громоздкого дорогостоящего оборудования, регулярного пополнения запасов жидкого азота, что сказывается на себестоимости хранения материала. Кроме того, такой тип консервации способствует изменению тромбогенности [1], в связи с чем востребованы эффективные криоконсерванты с максимальным сохранением биологических свойств консервируемых биообъектов.

Наилучшие результаты достигаются при использовании комбинированных криоконсервантов, содержащих как проникающие, так и непроникающие криопротекторы. Однако, несмотря на имеющиеся успехи в криоконсервации, существует ряд проблем, связанных с разрушением клеточных оболочек, из-за недостаточной эффективности [2] и токсичности ряда компонентов [3–5]. Целесообразным является внесение липидов, белков и углеводов в качестве компонентов природного происхождения [6–10], а также многоатомных спиртов [11] для уменьшения токсического действия компонентов, входящих в состав криоконсерванта, в том числе при замораживании венозной крови человека [12]. Выраженным защитным действием на клеточные мембраны обладает трегалоза [13–16], для которой подтвержден синергический эффект в комбинации с диметилсульфоксидом (ДМСО) [17].

Одним из направлений совершенствования криоконсервации является поиск новых нетоксичных компонентов, таких как лактулоза. В ходе исследований лактулозы данных о токсическом, тератогенном или мутагенном действии в опытах на животных и в клинических исследованиях с участием людей получено не было [18]. При этом отмечены защитные свойства лактулозы, повышающей выживаемость кисломолочных культур при заморозке. Внесение до 3% лактулозы в смесь с кисломолочными микроорганизмами способствовало увеличению числа жизнеспособных клеток культуры при замораживании продукции до температуры –18 °С [19]. Есть данные, что лактулоза в сочетании с лецитином оказывает криопротекторное действие на пробиотики при температуре –20 °C [20]. Таким образом, использование лактулозы может найти применение в практической деятельности для сохранения биологических объектов при замораживании в качестве нетоксичного компонента криоконсервантов.

Образцы свежей цельной крови наиболее предпочтительны для анализа, однако к недостаткам работы со свежей кровью относятся необходимость ее быстрого анализа после взятия биопробы и ограниченное число повторных анализов, которые могут быть выполнены без дополнительного взятия крови [21]. Описан опыт криоконсервирования в полевых условиях капиллярной крови с последующим анализом методом цитометрии, связанной с необходимостью немедленного анализа образцов [22], однако аналогичных данных о криоконсервировании венозной крови нет. Кроме того, актуальна сохранность гемопоэтических стволовых клеток периферической крови как процедура лечения гематологических, онкологических и аутоиммунных заболеваний [23].

Цель работы — оценить морфофункциональные особенности форменных элементов крови в криоконсерванте с лактулозой с учетом воздействия умеренно низкой температуры (–40 °С).

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Критерии включения пациентов в исследование: условно здоровые доноры в возрасте 18–23 лет женского пола в первой фазе менструального цикла, в количестве 30 человек, отсутствие хронических заболеваний в период обострения. Объект исследования — периферическая венозная кровь, стабилизированная К3 ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) in vitro.

Из числа проб периферической венозной крови, полученных от добровольцев доноров, были сформированы три группы. В контрольную группу вошли 10 образцов крови, в которой исследовали характеристики и параметры форменных элементов крови при температуре +20 ± 1,0 °С. В 1-ю опытную группу вошли 10 образцов крови, в которые был внесен криоконсервант. Данные образцы исследовали по истечении 4 ч, при температуре +20 ± 1,0 °С. Во 2-ю опытную группу вошли 10 образцов крови, в которые был внесен криоконсервант, при этом образцы были введены в состояние холодового анабиоза при температуре –40 °С на 24 ч. Далее образцы размораживали и исследовали характеристики и параметры форменных элементов крови при температуре +20 ± 1,0 °С.

При приготовлении модельного криоконсерванта были использованы растворы солей, поддерживающие изотоническую концентрацию. В качестве проникающих в клетку криокомпонентов использовали глицерин и ДМСО, в качестве не проникающего дисахарид лактулозу. Конечный состав модельного криоконсерванта имел следующие соотношения компонентов, об. %: глицерин (чда, Россия) — 20, ДМСО (хч, Россия) — 10, лактулоза (торговая марка «Лактусан» по ТУ 9229-004-53757476–04; Россия) – 2,5, хлорид натрия (чда, Россия) – 0,25, натрий фосфорнокислый двузамещенный (чда, Россия) — 0,25, вода для инъекций (Дальхимфарм; Россия) — до 100%.

Раствор криоконсерванта автоклавировали (без ДМСО) при 1,2 атм в течение 30 мин. Готовый раствор хранили в холодильнике при +2 — +4 °C. Стерилизацию ДМСО осуществляли с использованием установки стерилизующей фильтрации и хранили в стерильных пробирках при температуре –10 °С. Раствор ДМСО вносили в готовый стерильный криоконсервант непосредственно перед замораживанием образцов крови.

В образцы 1-й и 2-й опытных групп добавляли с помощью дозатора криоконсервант в соотношении кровь : криоконсервант как 2 : 1 по объему. Пробирки герметизировали пробками, содержимое перемешивали в течение 10 мин. Далее образцы 1-й опытной группы спустя 4 ч исследовали при температуре +20 ± 1,0 °С. Образцы 2-й опытной группы помещали в морозильную камеру электроморозильника с температурой –20 ± 1,0 °С в хладоагент в виде раствора 38–45 об.% этилового спирта 96 об.% с температурой холодовой адаптации –26 – –30 °С, объем замораживаемого образца составил 10% от объема хладагента, выдерживали в нем 30 мин и перемещали для окончательного замораживания и хранения в камеру электроморозильника с температурой –40 ± 1,0 °С на 24 ч. После этого образцы размораживали в водяной бане UТ-4334 (ULAB; Россия) при покачивании (2–3 раза/с) в ручном режиме при температуре +40 ± 1 °С в течение 1 мин. Далее исследовали характеристики и параметры форменных элементов крови при температуре +20 ± 1,0 °С. Компьютерное цитоморфометрическое исследование клеток крови выполняли на аппаратнопрограммном комплексе «МЕКОС-Ц2» («Медицинские компьютерные системы»; Россия). Для проведения in vitro диагностических тестов образцов крови в лабораторных условиях использовали автоматический гематологический анализатор «Гемалайт 1270» (Dixion; Россия). Для определения величины параметров RBC подсчитывали число клеток в суспензии клеток крови с разведением образца в соотношении 1 : 40 000. На гематологическом анализаторе определяли 21 лабораторный показатель, отражающий состояние лейкоцитарного, эритроцитарного и тромбоцитарного звена.

Для обработки полученных результатов использовали статистический пакет версии «IBM SPSS Statistic 23.0» (IBM Corp., Armonk, NY; USA). Характер распределения величин изучаемых показателей оценивали с помощью W-критерия Шапиро–Уилка. Уровень статистической значимости межгрупповых различий при соответствии распределения значений показателя закону нормального распределения оценивали с помощью параметрического t-критерия Стьюдента для несвязанных выборок, для показателей с ненормальным распределением — при помощи непараметрического U-критерия Манна– Уитни. Для показателей с нормальным распределением вычисляли среднее значение (Х), ошибку среднего (м) и стандартное отклонение (δ). Межгрупповые различия считали достоверными (статистически значимыми) при вероятности ошибки (p) ≤ 0,05 (5% вероятности).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Анализ лейкоцитарных показателей крови проводили в контрольной группе до внесения криоконсерванта. В 1-й опытной группе по истечении 4 ч с момента внесения криоконсерванта при температуре +20 ± 1,0 °С. Во 2-й опытной группе после размораживания образцов крови с криоконсервантом после 24-часовой инкубации при температуре –40 ± 1,0 °С (табл. 1).

При анализе лейкоцитарных данных, как в 1-й, так и во 2-й опытных группах, наблюдается тенденция к снижению показателей, однако количественное и процентное соотношение осталось в пределах референсного диапазона.

Проводили анализ компьютерной цитоморфометрии лейкоцитов в контрольной группе до внесения криоконсерванта, после его внесения и 4-часовой инкубации в 1-й опытной группе при температуре +20 ± 1,0 °С и во 2-й опытной группе после размораживания образцов крови с криоконсервантом при 24-часовой инкубации при температуре –40 ± 1,0 °С (табл. 2).

Полученные данные имеют тенденцию к снижению показателей, однако значения укладываются в пределы референсного диапазона изменений. При этом в 1-й и во 2-й опытных группах с внесенным криоконсервантом показатели демонстрируют стабильные значения: число ядер всего — 1, число сегментов ядра всего — 1, число включений/дырок в ядре — 0 и число хвостов ядра — 2.

Анализ эритроцитарных показателей проводили в контрольной группе до внесения криоконсерванта, после его внесения и 4-часовой инкубации в 1-й опытной группе при температуре +20 ± 1,0 °С и во 2-й опытной группе после размораживания образцов крови с криоконсервантом при 24-часовой инкубации при температуре –40 ± 1,0 °С (табл. 3).

При сравнительном анализе показателей общего анализа крови в контрольной группе, в 1-й и 2-й опытной группах при воздействии умеренно низкой температуры наблюдается тенденция к снижению показателей, однако количественное и процентное соотношение осталось в пределах референсных значений характеристик форменных элементов.

Проводили анализ компьютерной цитоморфометрии эритроцитов в контрольной группе до внесения криоконсерванта, после его внесения и 4-часовой инкубации в 1-й опытной группе при температуре +20 ± 1,0 °С и во 2-й опытной группе после размораживания образцов крови с криоконсервантом при 24-часовой инкубации при температуре –40 ± 1,0 °С (табл. 4).

Результаты сравнительного анализа контрольной и 1-й опытной группы демонстрируют тенденцию к снижению большей части показателей, однако полученные значения укладываются в пределы референсных значений характеристик форменных элементов. Данные, полученные в ходе сравнительного анализа во 2-й опытной группе, демонстрируют тенденцию к снижению по всем показателям, при этом полученные значения укладываются в пределы референсных значений характеристик форменных элементов и указывают на стабильность образцов на фоне криопротекторной нагрузки.

Анализ тромбоцитарных показателей проводили в контрольной группе до внесения криоконсерванта, после его внесения и 4-часовой инкубации в 1-й опытной группе при температуре +20 ± 1,0 °С и во 2-й опытной группе после размораживания образцов крови с криоконсервантом при 24-часовой инкубации при температуре –40 ± 1,0 °С (табл. 5).

При сравнительном анализе показателей общего анализа крови в контрольной и 1-й опытной группах при температуре +20 ± 1,0 °С выявлена тенденция к снижению уровня ряда показателей, однако все значения лежат на границе референсного диапазона. При анализе данных тромбоцитарных показателей во 2-й опытной группе наблюдается тенденция к снижению значений, однако количественное и процентное соотношение осталось в пределах условно допустимых референсных значений характеристик форменных элементов.

Проводили анализ компьютерной цитоморфометрии тромбоцитов в контрольной группе до внесения криоконсерванта, после его внесения и 2-часовой инкубации в 1-й опытной группе при температуре +20 ± 1,0 °С и во 2-й опытной группе после размораживания образцов крови с криоконсервантом при 24-часовой инкубации при температуре –40 ± 1,0 °С (табл. 6).

Анализ данных в контрольной и 1-й опытной группах при температуре +20 ± 1,0 °С демонстрирует тенденцию к снижению большей части показателей, однако полученные значения укладываются в пределы референсных значений характеристик форменных элементов. Данные, полученные в ходе сравнительного анализа во 2-й опытной группе, демонстрируют тенденцию к снижению уровня показателей, при этом укладываются в пределы референсных значений характеристик форменных элементов.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Результаты сравнительного анализа лейкоцитарных показателей контрольной и 1-й опытной группы с внесением криоконсерванта имели тенденцию к снижению большинства показателей, однако все значения укладывались в пределы референсного интервала. Такие показатели, как «число ядер всего — 1», «число сегментов ядра всего — 1», «число включений/дырок в ядре — 0» и «число хвостов ядра — 2», в контрольной группе и в 1-й опытной группе были идентичны. Полученные значения использовали в качестве сравнения с показателями образцов, подвергнутых замораживанию. При анализе данных компьютерной цитофотометрии лейкоцитарных показателей крови до и после внесения криоконсерванта при замораживании до –40 °С установлено, что во 2-й опытной группе показатели демонстрировали аналогичные значения по сравнению с группой контроля: число ядер всего — 1, число сегментов ядра всего — 1, число включений/дырок в ядре — 0 и число хвостов ядра — 2. При анализе показателей общего анализа крови и морфометрических характеристик лейкоцитов цельной крови в контрольной и опытных группах установили тенденцию к снижению их значений, однако все полученные данные не выходят за пределы допустимых значений характеристик форменных элементов. Так в контрольной группе показатели WBC — 10⁹/л составили 5,60 ± 0,92 (p < 0,01) в 1-й опытной группе — 4,55 ± 0,74 (p < 0,01), а во 2-й опытной группе — 4,14 ± 0,85 (p < 0,01). Показатели морфометрии лейкоцитов, такие как площадь клетки в мкм² в контрольной группе составили 70 ± 4,19 (p ≥ 0,1), в 1-й опытной группе — 59 ± 4,75 (p ≥ 0,1), во 2-й опытной группе — 70 ± 3,98 (p ≥ 0,1). 

В полученных результатах сравнительного анализа компьютерной цитоморфометрии эритроцитов в контрольной, 1-й и 2-й опытных группах с внесением криоконсерванта имела место тенденция к снижению уровня показателей, однако все значения укладывались в пределы референсного интервала. Анализ компьютерной цитоморфометрии эритроцитов во 2-й опытной группе с криоконсервантом при температуре замораживания –40 °С показал тенценцию к снижению, однако полученные результаты указывают на стабильность образцов и укладываются в пределы референсных значений характеристик форменных элементов крови. Так в контрольной группе RBC × 10¹²/л составили 4,62 ± 0,23 (p ≥ 0,05), в 1-й опытной группе — 4,08 ± 0,21 (p ≥ 0,05), во 2-й опытной группе — 3,5 ± 0,55 (p ≥ 0,05). Показатели морфометрии эритроцитов, такие как площадь клетки в мкм², в контрольной группе составили 46,6 ± 4,12 (p < 0,01), в 1-й опытной группе — 53,3 ± 4,68 (p < 0,01) и 2-й опытной группе — 41,1 ± 2,42 (p < 0,01) соответственно.

По результатам сравнительного анализа уровни большинства тромбоцитарных показателей в контрольной группе и в 1-й опытной группе с криоконсервантом в условиях комнатной температуры имели тенденцию к снижению, однако все значения укладывались в пределы референсных значений характеристик форменных элементов. При анализе тромбоцитарных показателей во 2-й опытной группе с криоконсервантом при инкубации при температуре –40 °С установлено, что количественное и процентное соотношение показателей имеет тенденцию к снижению, однако полученные значения укладываются в пределы референсных значений характеристик форменных элементов крови. Так уровень PLT × 10⁹/л в контрольной группе составил 230,8 ± 5,78 (p < 0,01), в 1-й опытной группе — 198,6 ± 5,36 (р < 0,01), во 2-й опытной группе — 150,1 ± 4,71 (p < 0,01). Показатели морфометрии эритроцитов, такие как площадь клетки в мкм² в контрольной группе составили 7,7 ± 0,21 (p ≥ 0,1), в 1-й опытной группе — 7,5 ± 0,36 (p ≥ 0,1), во 2-й опытной группе — 7,2 ± 0,31 (p ≥ 0,1) соответственно.

По результатам анализа исследований, посвященных поиску новых эффективных криоконсервантов, большое количество работ посвящено криоконсервированию эритроцитов, нежели тромбоцитов и лейкоцитов. При использовании в качестве криоконсерванта раствора «Криосин» сохранность эритроцитов составила 83,8 ± 4,09% [24]. При оценке жизнеспособности ядросодержащих клеток в лейкоконцентратах на этапах их получения, замораживания и декриоконсервирования были получены следующие данные: в результате отмывания от ДМСО в жизнеспособном состоянии сохраняется существенно больше клеток, чем без отмывания — 94,4% против 86,7% [25]. При замораживании тромбоцитов крови доноров под защитой комбинированного криоконсерванта сохранялась их функциональная активность в пределах 63,5–88,8% [26]. Таким образом, данные, полученные в ходе настоящего исследования, сопоставимы с результатами литературных данных по анализу сохранности отдельных форменных элементов крови в ходе криоконсервирования.

Разработанный криоконсервант с лактулозой является эффективным в условиях замораживания до –40 °С и доступным (все компоненты производятся на территории Российской Федерации), что расширяет спектр применяемых криоконсервантов и позволит провести анализ морфофункциональных параметров образцов замороженной цельной крови при крупномасштабных исследованиях в условиях чрезвычайных ситуаций, при ликвидации последствий аварий техногенного или природного происхождения, террористических актов, вооруженных конфликтов, хранения биоматериала в длительных экспедициях и отдаленных местностях. Кроме того, перспективен персонализированный подход к трансфузии компонентов крови при экстренной необходимости переливания собственной криоконсервированной цельной крови для снижения риска влияния чужеродных комплексов на организм реципиента. Представленные данные свидетельствуют о необходимости дальнейшего изучения влияния лактулозы в качестве криокомпонента на сохранность биообъектов.

ВЫВОДЫ

В ходе обработки полученных данных выявлена морфологическая и функциональная сохранность форменных элементов крови в разработанном криоконсерванте с лактулозой после замораживания в течение 24 ч при температуре –40 °С: для эритроцитов — 85,3 ± 0,30 % (p < 0,05), для тромбоцитов — 75 ± 0,71 % (p < 0,05), для лейкоцитов — 90,1 ± 0,91% (p < 0,05) от значений, зарегистрированных до замораживания. В свете современных исследований, посвященных поиску новых эффективных криоконсервантов, лактулоза может найти применение в качестве нетоксичного компонента при разработке криосоставов для сохранения биологических объектов при замораживании.