Pseudomonas aeruginosa является актуальным патогеномоппортунистом, успех в поддержании жизнедеятельности которого в клинических условиях обусловлен высоким адаптивным потенциалом. Быстрая адаптация к новым экологическим локусам, антимикробным препаратам и эффекторам иммунной системы позволяет P. aeruginosa оставаться одной из главных причин нозокомиальной заболеваемости [1]. Инфекции, вызванные полирезистентыми штаммами P. aeruginosa, трудно поддаются лечению, и лишь немногие антимикробные препараты сохраняют активность в отношении таких возбудителей. Одним из антибиотиков «последнего шанса» является полимиксиновый антибиотик колистин [2].

Расширение клинического использования колистина неизбежно приводит к появлению колистинрезистентности. Устойчивость к колистину обусловлена изменением структуры его мишени — липополисахарида (ЛПС), что снижает связывание антибиотика с клеточной стенкой бактерии [3]. Модификация ЛПС и резистентность к колистину у P. aeruginosa обычно связаны с повреждением двухкомпонентных систем PhoP-PhoQ и PmrA-PmrB в результате мутаций соответствующих генов, хотя и не ограничивается этими механизмами [3, 4]. Мутации, формирующие устойчивость, дают преимущество их носителям при наличии антибиотика, однако эти же мутации могут снижать уровень жизнеспособности микроорганизма в целом, который в отсутствие антибиотика становится неконкурентоспособным. Компенсировать биологические затраты, связанные с резистентностью, могут мутации, которые запускают альтернативные пути метаболизма в клетке и замещают выпадающие звенья обмена веществ [5–7]. В связи с этим исследование бактериального фитнеса, т. е. уровня поддержания жизнедеятельности, который может быть выражен, в частности, в изменении темпов роста бактериальной популяции [8], служит важным дополнением к генетическому анализу механизмов резистентности.

В недавно проведенном исследовании, посвященном экспериментальной адаптации P. aeruginosa к колистину, мы показали, что при формировании колистинрезистентности геном эволюционировал альтернативными путями не только у разных штаммов, но и в пределах одного штамма бактерий [9]. Изоляты одного из экспериментальных штаммов P. aeruginosa, полученные на различных этапах адаптации к колистину и проанализированные при помощи полногеномного секвенирования, мы использовали в настоящей работе. Для исследования были отобраны изоляты с разными мутациями, у которых исследовали кинетику роста и сравнили ее с родительским штаммом. Цель работы — исследовать взаимосвязь генотипических и фенотипических характеристик в экспериментальных моделях, что подчеркивает важность исходного генетического фона в развитии устойчивости к антимикробным препаратам, позволяет вскрыть новые знания о механизмах антибиотикорезистентности и наметить новые пути преодоления лекарственной устойчивости бактерий.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследовали штамм P. aeruginosa (лабораторный номер 1202, геном депонирован в GenBank), выделенный из окружающей среды в 2016 г., чувствительный ко всем антибиотикам, и его дочерние изоляты, полученные в ходе экспериментальной адаптации к колистину, методика которой была подробно описана ранее [9].

Для оценки бактериального фитнеса сравнивали темпы роста родительского и дочерних штаммов Pa_1202, полученных в ходе адаптационного эксперимента. Из единичной колонии суточной культуры каждого изолята готовили бактериальную суспензию, стандартизировали ее по оптической плотности до 0,5 ед. McFarland, инокулировали 10 мкл полученной взвеси в 10 мл бульона Луриа–Бертани, после чего отбирали 200 мкл и переносили в лунку 96-луночного плоскодонного планшета. Планшет заклеивали прозрачной пленкой и инкубировали в многофункциональном ридере Varioskan LUX (Thermo Scientific, США) в течение 18 ч при 37 °С, каждые 15 мин измеряя оптическую плотность (ОП) при λ = 600 нм. Кривые роста анализировали при помощи программы SkanIt версии 7.0 (Thermo Scientific; США). Темпы роста оценивали при помощи двух следующих показателей: 1) максимальная скорость роста (СР_max; соответствует максимальному изменению ОП в течение 1 ч, единица измерения ОП/ч); 2) время, необходимое для достижения 50% от максимальной ОП, зарегистрированной при росте родительского штамма Pа_1202_0 (Т_ОП_50%) (рисунок). Уменьшение СРmax и увеличение Т_ОП_50% расценивали как снижение фитнеса. Эксперимент проводили в трех повторах.

Минимальную подавляющую концентрацию (МПК) колистина в диапазоне 0,25–16 мг/л определяли наборами ComASP Colistin 0,25-16 (Liofilchem srl., Италия), а более высокие МПК (до 64 мг/л) оценивали при помощи метода микроразведений в бульоне. Значения МПК интерпретировали, исходя из их экспериментальной динамики, но не клинической значимости.

Полногеномное секвенирование проводили с использованием бактериальной ДНК, выделенной из суточных культур экспериментальных изолятов Ра_1202, выращенных из замороженных образцов (см. выше) на агаре Мюллера–Хинтона. Процедура полногеномного секвенирования и биоинформатического анализа подробно описана ранее [9].

Статистическую обработку проводили в программе IBM SPSS Statistics, v 27.0. (США). Количественные результаты в тексте и таблица представлены в виде среднего (стандартное отклонение). Для сравнения показателей СР_max и Т_ОП_50% использовали тест Манна–Уитни, различия считали статистически значимыми при p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Темпы роста проанализировали у родительского штамма Ра_1202_0  и у 9 изолятов Ра_1202, которые представляли три основные клональные линии, полученные в ходе экспериментальной адаптации к колистину  и описанные нами ранее [9] (таблица). Два клона носили идентичную мутацию в phoQ (ins-ATCGCCT-1086), но различались по мутациям в других генах. В одном случае дополнительные повреждения были обнаружены в генах lptA (ins-CCGCGC-490) и prs (T143→C), клон назвали Ра_phoQ/lptA/prs. В другом случае были изменены гены lpxL (ins-C-335) и lptB (ins-GCG-27), клон назвали Ра_phoQ/lpxL/lptB. Третий клон характеризовался мутацией в гене pmrB (T92→G) (клон назвали Ра_pmrB) в сочетании с повреждением гена hp/PA2117 (G326→A).

Изоляты клона Ра_phoQ/lptA/prs отличались низкими показателями фитнеса по сравнению с родительским штаммом Ра_1202_0 (см. рисунок и таблица). Например, СР_max изолята 1202_43 составила 0,029 (0,001) ОП/ч против 0,182 (0,018) ОП/ч у исходного изолята Ра_1202_0, а ОП50% он достигал на 4,6 ч позже.

Ростовые характеристики клонов Ра_ lpxL/lptB и Ра_pmrB в целом были сопоставимы с показателями родительского штамма Ра_1202_0 (таблица). У двух изолятов отмечены значимое повышение СР_max (1202_63) и значимое снижение Т_ОП_50% (1202_88), что указывало на лучшие темпы роста по сравнению с родительским штаммом, несмотря на 16-кратное увеличение МПК колистина (таблица). У изолята 1202_95 из клона Ра_pmrB была значимо снижена СР_max, однако Т_ОП_50% отличалась незначимо от исходного штамма.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В настоящей работе мы показали, как экспериментальная адаптация P. aeruginosa к колистину влияла на бактериальный фитнес, оценив кинетику роста изолятов с различными генотипами. Различия фитнес-способностей между представителями трех изученных клонов логичнее всего объяснить, анализируя профили геномных альтераций, характерных для каждого клона. Геномы изолятов клона Ра_phoQ/lptA/prs включали два типа изменений: 1) мутации в генах phoQ и lptA, которые непосредственно контролируют биосинтез главной мишени полимиксинов — ЛПС [10, 11]; 2) мутации в гене рибозофосфатпирофосфокиназы prs, который напрямую не связан с синтезом ЛПС и контролирует синтез и метаболизм нуклеотидов. PhoP, компонент регуляторной системы PhoPQ, непосредственно участвует в регуляции синтеза ЛПС, его поломки считают частой причиной колистинрезистентности [10]. Продукт гена lptA обеспечивает сборку ЛПС и его транслокацию в наружную мембрану [11]. Комплексные изменения генома в клоне Ра_phoQ/lptA/prs сочетались с наиболее выраженным понижением бактериального фитнеса.

У клона Ра_phoQ/lpxL/lptB были обнаружены мутации только в генах синтеза ЛПС, включая уже упоминавшийся phoQ, lpxL (ген лауроилацилтрансферазы, осуществляющей биосинтез липида А) и lptB (ген транспортера LptB2FG, перемещающего ЛПС в наружную мембрану) [12, 13].

Клон Ра_pmrB сочетал мутации в генах сенсор-киназы pmrB и гипотетического протеина hp/PA2117. Киназа PmrB является элементом двухкомпонентной системы, которая регулирует множество функций, включая экспрессию генов ЛПС-оперона; ранее было доказано, что повреждения гена pmrB снижают чувствительность P. aeruginosa к полимиксинам [14, 15]. Продукт гена hp/PA2117 до настоящего времени не верифицирован.

ВЫВОДЫ

Модификации генома, наблюдавшиеся в ходе адаптации P. aeruginosa к колистину, оказывают неоднозначное влияние на бактериальный фитнес. Очевидно, что наиболее тяжелые последствия для приспособленности бактерий несет сочетание мутаций в генах ЛПС-синтеза и генах общего метаболизма, как наблюдалось в клоне Ра_phoQ/lptA/prs. Дальнейшее изучение взаимоотношений генотипа и фенотипа при помощи экспериментального моделирования позволит улучшить понимание механизмов бактериальной адаптации к факторам внешней среды, в том числе формирования антибиотикорезистентности, и наметить новые пути преодоления лекарственной устойчивости бактерий.