В 1993 г. была описана короткая РНК нематоды Caenorhabditis elegans, которая не кодировала белок, но играла ключевую роль в регуляции развития нематоды, подавляя трансляцию мРНК белка LIN-14 [1, 2]. Эта малая РНК, названная lin-4, стала первой обнаруженной короткой РНК с регуляторными свойствами. В 2000 г. у Caenorhabditis elegans обнаружили вторую короткую РНК — let-7 с аналогичным механизмом действия [3]. С этого момента началось бурное изучение нового типа малых некодирующих РНК длиной 21–24 нуклеотида, названных микроРНК (miRNA), открытие которых значительно повлияло на устоявшиеся представления о регуляции работы генов. Если до этого открытия были известны основные механизмы регуляции процессов транскрипции и сплайсинга РНК, осуществляемые специальными белками в ядре, то теперь к ним добавилось представление о последующем контроле экспрессии генов в цитоплазме с помощью микроРНК. Этот механизм имеет фундаментальное значение для развития и функционирования всех типов клеток и заключается в регуляции экспрессии генов-мишеней посредством взаимодействия с их мРНК на посттранскрипционном уровне. Присутствие молекул микроРНК обнаружено у разных видов эукариот, включая растения и животных, а также у некоторых вирусов [4]. В 2024 г. В. Эмбросу и Г. Равкану присуждена Нобелевская премия по физиологии или медицине «за открытие микроРНК и их роли в посттранскрипционной регуляции гена».

За прошедшие годы установлено, что многочисленные микроРНК регулируют практически все физиологические и патологические процессы: от первых стадий эмбриогенеза до старения и смерти организма. Рассмотрим современное состояние знаний о биогенезе и функционировании микроРНК.

Распространенность микроРНК и их номенклатура

По данным последней версии miRBase, базы данных последовательностей и аннотаций микроРНК, на 17.03.2024 всего у 271 вида найдено 48 860 зрелых микроРНК, из них 2654 идентифицированы в организме человека. Число обнаруженных микроРНК продолжает расти. Спектр микроРНК, присутствующих у того или иного организма, напрямую зависит от сложности его строения [5]. Эволюционно родственные микроРНК объединены в различные семейства (у человека их 267), члены которых имеют высокогомологичные последовательности и некоторые общие мишени. Показана высокая консервативность нуклеотидных последовательностей некоторых микроРНК (в первую очередь в области связывания с мРНК-мишенью) в филогенезе. В целом, эволюция микроРНК тесно связана с эволюцией геновмишеней [5].

МикроРНК нумеруют последовательно в порядке их открытия. Экспериментально подтвержденным зрелым микроРНК присваивают номер, который присоединяется к префиксу «miR» через дефис (например, miR-499). Перед «miR» может стоять трехбуквенное сокращение, указывающее на вид (например, для Homo sapiens — «hsa», для Mus musculus — «mmu»). К одинаковым по последовательности микроРНК, считывающимся с разных областей генома, добавляют числовой суффикс с порядковым номером, например, hsa-miR-219-1 и hsamiR-219-2. К названиям микроРНК, последовательности которых отличаются незначительно (на 1–2 нуклеотида), прибавляют буквенный суффикс, например, hsa-miR-130a и hsa-miR-130b; они формируют семейства. МикроРНК, гены которых физически расположены недалеко друг от друга и зачастую транскрибируются как единое целое, объединяют в кластеры, которые именуют либо по наименьшему номеру микроРНК в кластере (например, кластер miR-17), либо по наименьшему и наибольшему номерам микроРНК через дефис (кластер miR-17-92, состоящий из miR-17, miR-91, miR-18, miR-19, miR-19b, miR-20 и miR-92) [6].

Гены и биогенез микроРНК

Гены микроРНК в зависимости от их локализации относительно элементов генома можно отнести к межгенным, интронным и экзонным. Около 50% генов известных микроРНК расположены внутри белок-кодирующих и белок-некодирующих генов (гены-хозяева), по большей части в интронах и реже в экзонах. Гены микроРНК могут транскрибироваться как с самостоятельных промоторов, так и с промотора гена-хозяина [7]. Новые гены микроРНК образуются или в результате дупликации существующих генов микроРНК (так происходит в большинстве случаев), или de novo из шпилечных структур, расположенных внутри интронов или межгенных областей [8]. Структуры de novo возникают посредством различных механизмов: 1) инвертированной дупликации гена, который впоследствии станет мишенью микроРНК; 2) из генов транспозонов; 3) спонтанной эволюции из случайных последовательностей [8].

Наиболее распространенный путь биогенеза микроРНК получил название канонического. Помимо него, описаны другие пути образования микроРНК, в которых участвуют другие белки и пропущены один или несколько этапов канонического биогенеза; их называют неканоническими [9].

Канонический путь биогенеза микроРНК

У животных в каноническом варианте с гена микроРНК с помощью РНК-полимеразы II транскрибируется первичная микроРНК (pri-miRNA, primary miRNA), которая затем подвергается 5'-кэпированию, 3'-полиаденилированию и сплайсингу (рис. 1).

Далее микропроцессорный комплекс, состоящий из рибонуклеазазы III (Drosha) и белка DGCR8 (DiGeorge Syndrome Critical Region 8, он же Pasha — Partner of Drosha), разрезает первичную микроРНК до пре-микроРНК (предшественник микроРНК, precursor miRNA, pre-miRNA) длиной 70–120 нуклеотидов. Пре-микроРНК представляет собой шпильку, состоящую из одноцепочечного участка (терминальная петля) и двуцепочечного стебля со свободно выступающими двумя нуклеотидами на 3'-конце. Выступающие нуклеотиды распознаются белком экспортином-5 (XPO5), который при участии ГТФсвязывающего белка Ran переносит пре-микроРНК из ядра в цитоплазму. В цитоплазме (рис. 1, справа) рибонуклеаза III Dicer вырезает из пре-микроРНК терминальную петлю, в результате чего образуется дуплекс из двух зрелых микроРНК длиной 21–24 нуклеотида [10]. В зависимости от положения зрелой цепи микроРНК в шпильке пре-микроРНК их названия сопровождаются суффиксами -3p или -5p (например, цепь hsa-miR-25-5p локализована на 5'-конце пре-микроРНК hsa-miR-25, а цепь hsa-miR25-3p — на 3'-конце). После вырезания терминальной петли дуплекс микроРНК связывается с белком семейства Argonaute (AGO) в составе комплекса RISC (RNA-induced silencing complex, РНК-индуцированный комплекс сайленсинга генов) — так образуется промежуточный пре-RISC-комплекс. Одна из двух цепей РНК-дуплекса диссоциирует и, как правило, подвергается деградации, а другая остается в составе комплекса miRISC. Цепь, оставшуюся в составе этого комплекса, называют направляющей, а диссоциирующую — пассажирской [10]. Далее происходит связывание направляющей цепи микроРНК в составе комплекса miRISC с мРНК-мишенью.

У растений канонический путь несколько отличается от такового у животных. При-микроРНК процессируется в ядре сразу до микроРНК-дуплекса с помощью белкагомолога Dicer, DICER-LIKE 1 (DCL1), который отвечает за оба события процессинга, необходимые для созревания микроРНК [4]. Предшественник стеблевой петли у растений длиннее и более изменчив. В отличие от билатеральных животных, у растений микроРНК подвергаются метилированию с помощью белка HEN1.

Неканонические пути биогенеза микроРНК

В процессинге при неканонических (альтернативных) путях созревания микроРНК принимают участие не все белки канонического пути. Выделяют Drosha- и DGSR8независимые (микропроцессор-независимые) и Dicerнезависимые пути биогенеза микроРНК. В большинстве Drosha-независимых путей предшественники микроРНК являются побочными продуктами процессинга других РНК (например, малой ядерной РНК или транспортной РНК) и не требуют гидролиза микропроцессорным комплексом [11]. При Dicer-независимом процессинге осуществляется гидролиз при-микроРНК микропроцессорным комплексом, но получающийся в итоге стебель шпилечной структуры слишком короток для узнавания Dicer. Вследствие этого предшественник микроРНК напрямую загружается на белок AGO, который надрезает одну из цепей микроРНК, а затем полученный при помощи poly(А)-специфичной рибонуклеазы (PARN) промежуточный продукт укорачивается до получения зрелой молекулы [10].

Выбор функционально активной цепи микроРНК

Выбор направляющей цепи между цепями -5p и -3p связан с термодинамической нестабильностью дуплекса и нуклеотидным составом микроРНК [12]. 5'-конец микроРНК-дуплекса встраивается в специальный карман, сформированный доменами MID и PIWI белка AGO. Эти домены чувствительны к нуклеотидному составу дуплекса и связывают урацил в два раза сильнее, чем аденин, и в 30 раз сильнее, чем цитозин или гуанин, т. е. предпочтение отдается цепи, богатой урацилом на 5'-конце. AGO также, по-видимому, предпочитает загружать ту цепь дуплекса, которая имеет более низкую относительную термодинамическую стабильность. Считается, что за термодинамическую стабильность отвечают первые четыре нуклеотида на каждом конце дуплекса, а разница в одну дополнительную водородную связь на одном из концов  достаточна, чтобы повлиять на выбор направляющей и пассажирской цепей. Как правило, 5'-концы деградирующих пассажирских цепей богаты пиримидином, а направляющих цепей — пуринами [12].

Распознавание и связывание мРНК-мишени молекулой микроРНК

Комплекс miRISC, связанный с мРНК-мишенью, взаимодействует с белком GW182 (белок, содержащий глицин-триптофановый повтор 182 кДа).  GW182 действует как молекулярный каркас для соединения белка AGO в составе комплекса miRISC и нижестоящих эффекторных комплексов, участвующих в микроРНК-опосредованной трансляционной репрессии мРНК-мишени [7].

Для облегчения распознавания и связывания мРНКмишеней белок AGO позиционирует направляющую цепь микроРНК в пространстве. Участок направляющей цепи микроРНК со второго по седьмой нуклеотид на 5′-конце называют затравочной областью (seed region); он отвечает за связывание мРНК-мишени и имеет решающее значение для ее распознавания [13]. В распознавании участвуют также нуклеотиды 8 и 13–16 последовательности микроРНК [10]. Обычно в молекуле мРНК-мишени сайт связывания с miRISC находится в 3'-нетранслируемой области (3'-UTR). Описаны достаточно редкие неканонические сайты связывания в кодирующей и 5'-UTR областях мРНК, взаимодействуя с которыми микроРНК также подавляют трансляцию мРНК. В ряде случаев микроРНК могут взаимодействовать с промоторной областью генов, активируя их транскрипцию [14].

Механизмы микроРНК-опосредованного подавления экспрессии генов

Как сказано выше, распознавание молекулой микроРНК мРНК-мишени, как правило, приводит к подавлению трансляции этой мРНК. При полной комплементарности, наблюдаемой преимущественно у растений, мРНК-мишень разрезается внутри miRISC белком AGO, обладающим эндонуклеазной активностью РНКазы Н, в участке, комплементарном нуклеотидам 10 и 11 направляющей цепи микроРНК (эндонуклеазное расщепление мРНК) [4, 15]. В большинстве клеток животных сайты связывания в мРНК не полностью комплементарны затравочной области микроРНК. В этом случае инициируются miRISCопосредованные репрессия трансляции и дестабилизация мРНК-мишени с ее последующей деградацией [7].

Хотя точные механизмы этих процессов у млекопитающих остаются предметом изучения, общепризнанно мнение, что поначалу происходит репрессия трансляции, а позже — дестабилизация и распад мРНК-мишени [16]. Описано несколько механизмов репрессии трансляции, один из которых — ингибирование формирования «закрытой петли» мРНК-мишени (рис. 2A). Белок PABPC, связанный с 3′-поли(A)-хвостом мРНК-мишени, стабилизирует взаимодействие 5′-кэпа с комплексом фактора инициации трансляции эукариот 4F, состоящего из eIF4A, eIF4G и eIF4E, посредством связывания с eIF4G. Концы мРНК сближаются, и образуется структура «закрытая петля», облегчающая инициацию трансляции и рециклинг рибосом.

Белок AGO в составе miRISC-комплекса вызывает диссоциацию белка PABPС, что приводит к нарушению формирования «закрытой петли» и ингибированию инициации трансляции. К другим механизмам относят ингибирование инициации трансляции мРНК за счет препятствия сборке комплекса фактора инициации трансляции эукариот 4F. Они включают привлечение miRISC-комплексом ингибиторов трансляции 4E-T и 4EHP с последующей диссоциацией eIF4E и eIF4G или диссоциацию субъединицы eIF4A (рис. 2Б, справа). Механизмы не являются взаимоисключающими и могут работать одновременно с разной скоростью. Преобладание конкретного механизма зависит от природы отдельных мРНК-мишеней и типа клеток [16]. После репрессии трансляции происходит дестабилизация мРНК-мишени, включающая деаденилирование и декэпирование с последующей экзонуклеолитической деградацией мРНК (микроРНК-опосредованный распад мРНК-мишени) (рис. 2Б, слева). Вначале белки семейства AGO рекрутируют белок GW182, который, взаимодействуя с  поли(А)-связывающим белком РАВРC, вызывает его диссоциацию от поли(А)-хвоста мРНК. Это увеличивает доступность поли(А)-хвоста мРНК для деаденилаз CCR4NOT и PAN2-PAN3, которые также привлекаются белком GW182. В результате происходит деаденилирование мРНК. Кроме того, комплекс CCR4-NOT привлекает белки DCP1 и DCP2, декэпирующие мРНК-мишени, что делает их доступными для  деградации экзонуклеазой XRN1 [16].

МикроРНК свойственна избыточность (или вырожденность): уровень экспрессии одной мРНК могут регулировать разные микроРНК, для которых есть свои сайты посадки. При этом  микроРНК  обладает плейотропностью: одна микроРНК может взаимодействовать с разными мРНК-мишенями. У животных за счет часто встречающейся неполной комплементарности у одной микроРНК гораздо больше мишеней, чем у растений [4]. Сочетание этих свойств приводит к формированию сложной  микроРНКопосредованной регуляторной сети.

Локализация микроРНК в клетке

Ранее предполагалось, что микроРНК выполняет свою функцию только в цитоплазме. Однако недавние исследования показали, что цитоплазматический комплекс miRISC может быть импортирован в ядро [18]. Ядерный miRISC-комплекс по составу либо аналогичен цитоплазматическому, либо может существовать в виде отдельного комплекса AGO-микроРНК. Ядерный miRISC связывается с комплементарными ядерными транскриптами или, в отсутствие таковых, снова экспортируется в цитоплазму. Накопление микроРНК в цитоплазме или в ядре частично определяется локализацией ее мРНК-мишеней. В ядре микроРНК может выполнять ряд функций: 1) регуляцию экспрессии генов путем связывания с их промотором; 2) связывание и подавление функции длинных некодирующих РНК; 3) нарушение биогенеза микроРНК посредством связывания с при-микроРНК; 4) точную настройку экспрессии мРНКмишени за счет удержания микроРНК в ядре [19].

Известно, что микроРНК могут высвобождаться из клетки, переноситься с током крови и воздействовать на другие клетки организма, опосредуя межклеточную коммуникацию. Вне клетки микроРНК могут находиться в составе мембранных пузырьков — экзосом, микровезикул, а также в апоптотических тельцах, которые образуются в результате гибели клеток. Во внеклеточной среде большая часть микроРНК (90%) переносится белками AGO, остальные 10% циркулируют в комплексе с липопротеинами высокой плотности [20].

Вовлеченность микроРНК в физиологические и патологические процессы в клетке

МикроРНК регулируют практически все процессы в клетке: метаболизм, прохождение по клеточному циклу, пролиферацию, дифференцировку и апоптоз, поэтому нарушение их регуляторных свойств может приводить к различным заболеваниям [21]. Действительно, изменения в уровнях микроРНК у человека наблюдаются при широком спектре патологий: при опухолевых, сердечно-сосудистых, неврологических и аутоиммунных заболеваниях, воспалении, заболеваниях желудочно-кишечного тракта и скелетной мускулатуры [22]. С момента открытия микроРНК их роль активно исследуют в контексте различных патологий, и на данный момент накоплены сведения о том, уровни каких микроРНК наиболее часто изменяются в пораженных тканях при определенных состояниях, какие из микроРНК обладают протективным эффектом, а какие — наоборот, способствуют формированию патологического фенотипа.

МикроРНК изучают как непосредственно в образцах тканей пациентов, так и в экспериментах in vivo, in vitro, а также in silico, используя последний подход для построения предварительных гипотез. Среди всех биологических материалов пациентов для исследования роли микроРНК в этиопатогенезе лучше всего подходят биоптаты пораженных тканей, однако их получение связано с инвазивным вмешательством, и, как правило, они труднодоступны. В связи с этим чаще всего объектом исследования становятся циркулирующие микроРНК. Это микроРНК, которые в результате повреждения тканей, апоптоза, некроза или активной секреции из клеток высвобождаются во внеклеточное пространство и циркулируют в организме [7]. Такие микроРНК обнаруживаются в плазме и сыворотке крови, моче, слезах, слюне, в семенной, перитонеальной и спинномозговой жидкостях, грудном молоке и бронхиальных лаважах [7]. Они могут регулировать активность клеток-мишеней, выступая тем самым в качестве межклеточных сигнальных молекул. Например, секретируемые из эндотелия микроРНК регулируют активность гладкомышечных клеток сосудов, а онкогенные микроРНК в экзосомах увеличивают инвазивность клеток рака молочной железы [23, 24].

Циркулирующие микроРНК стабильны при высоких pH и температуре и устойчивы к деградации, поэтому представляются привлекательными кандидатами для использования в качестве биомаркеров. И действительно, имеются работы, в которых эти циркулирующие молекулы используют для дифференциальной диагностики, ранней диагностики, прогноза течения заболеваний, оценки тяжести патологии или для контроля ответа на терапию [25]. Поскольку микроРНК могут регулировать трансляцию нескольких мРНК-мишеней, некоторые авторы предлагают оценивать диагностическую способность не одной определенной микроРНК, а набора микроРНК (сигнатур), который будет более специфичным для заболевания [26]. Например, оценка уровня набора из трех микроРНК в моче при волчаночном нефрите позволяет выявить ранний фиброз почек и прогнозировать развитие почечной недостаточности [27].

Использование микроРНК для терапевтических целей основано либо на  восполнении уровней необходимых микроРНК с помощью введения соответствующих синтетических аналогов (миметиков микроРНК), либо на ингибировании целевых микроРНК путем введения антисмысловых микроРНК или же микроРНК-губок (их еще называют «конкурирующие эндогенные РНК») — транскриптов псевдогенов, длинных некодирующих РНК, кольцевых РНК и мРНК, которые связывают пул микроРНК, конкурируя с их мишенями. Так, miR-34a подавляет экспрессию более 30 онкогенов, участвующих в уклонении опухолевых клеток от иммунной системы. Поскольку экспрессия этой микроРНК часто снижена при различных злокачественных опухолях, был разработан синтетический миметик miR-34a, MRX34, для лечения злокачественных опухолей кожи, легких, почек и печени [28]. В настоящее время у ряда биофармацевтических компаний (Santaris Pharma, Roche Pharmaceuticals, Regulus therapeutics, Mirna Therapeutics Inc., miRagen Therapeutics и EnGeneIC) имеются программы применения микроРНК для терапии опухолей. Хотя несколько клинических испытаний микроРНК как потенциальных лекарственных средств было прекращено из-за серьезных побочных эффектов и токсичности, исследования применения микроРНК в терапевтической практике продолжаются и вселяют большие надежды [29].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

30 лет со времени открытия микроРНК — это немалый срок, в течение которого число исследований микроРНК неуклонно возрастало. Накопленные за это время данные не только расширили наши знания о механизмах регуляции активности генов, но и открыли новые горизонты в понимании их роли в физиологических и патологических процессах, протекающих в организме. При многих патологиях микроРНК могут служить в качестве надежных биомаркеров, а в ряде случаев модуляция активности микроРНК используется для терапии различных заболеваний. Однако всесторонний анализ участия отдельных микроРНК в клеточных процессах или в патогенезе конкретных заболеваний выходит за рамки нашей работы. Мы постарались познакомить читателя с широким спектром возможностей, которыми обладают эти малые РНК, и с перспективами их дальнейшего изучения и использования.