Десневая жидкость — это локальная биосреда зубодесневой борозды, отражающая физико-химическое состояние тканей зубодесневого комплекса. Ее состав определяется белками, пептидами, компонентами воспалительного экссудата и продуктами тканевого ремоделирования, поэтому она удобна для спектроскопического анализа. В отличие от таргетных биохимических методов, ИК-Фурье (FTIR)-спектроскопия позволяет получать интегральную молекулярную характеристику малого объема образца и оценивать перераспределение вкладов различных конформационных состояний белковой составляющей образца [1–4].

Для детской стоматологии эта тема особенно актуальна, однако данные о локальных молекулярных маркерах десневой жидкости у детей пока ограничены. Современные обзоры показывают, что воспалительные изменения десны у детей и подростков встречаются часто, а на состояние тканей дополнительно влияют возраст, стадия прикуса, пубертатные изменения, уровень зубного налета и ортодонтическая нагрузка [5–7]. В связи с этим десневая жидкость представляет интерес как малоинвазивный аналитический субстрат, который можно отбирать повторно и соотносить с конкретным участком зубодесневого комплекса [1, 5–6]. Теоретически на такие спектральные сдвиги могут влиять микробные факторы, локальный протеолиз, окислительный стресс и воспалительно-ремоделирующие процессы, меняющие состав и конформационное состояние белков в десневой жидкости.

Особый интерес для анализа белковой составляющей представляет область полосы Амид III, чувствительная к вкладу α-спиральных, β-складчатых, β-поворотных и неупорядоченных структур. По сравнению с областями Амид I и Амид II, ее интерпретация в меньшей степени осложняется влиянием воды и водородно-связанного фона, что особенно важно при исследовании малых объемов водосодержащих биосред, к которым относится десневая жидкость [4, 8–10]. Вместе с тем для корректной трактовки спектров белковых систем в этой области необходим учет перекрывания ИК-полос, выбор схемы предварительной обработки и параметров деконволюции [4, 8–10]. Поэтому в сложных биосредах целесообразно рассматривать не отдельные пики как прямые маркеры, а интегральный спектральный профиль как отражение направленных изменений белковой составляющей [4, 8].

Дополнительным ограничением подобных исследований является небольшой объем выборки, что требует применения методов многомерного анализа, адаптированных к спектральным данным и ограниченному числу наблюдений. Ранее было показано, что многомерный анализ ИКспектров десневой жидкости позволяет выявлять скрытые закономерности, связанные с клиническим статусом и индивидуальными особенностями пациента [11]. Это делает сочетание деконволюции полосы Амид III и многомерного статистического анализа перспективным подходом к изучению направленных изменений вторичной структуры белков в десневой жидкости [11].

Мы исходили из рабочей гипотезы, что при кариесе и воспалительных изменениях десны профиль полосы Амид III десневой жидкости у детей будет изменяться направленно за счет перераспределения спектральноассоциированных компонент, соответствующих различным элементам вторичной структуры белков. Целью настоящей работы было выявить такие направленные изменения спектрального профиля полосы Амид III и оценить возможность их рассмотрения в качестве кандидатных спектральных признаков изменений белковой составляющей десневой жидкости.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Дизайн исследования и характеристика выборки

В исследование включили 20 детей в возрасте 8–14 лет, у которых после стоматологического обследования выполняли забор десневой жидкости. Критерии включения: возраст 8–14 лет; наличие информированного добровольного согласия законных представителей; возможность проведения стандартного стоматологического обследования и забора десневой жидкости; отсутствие на момент обследования антибактериальной и иной терапии, способной существенно повлиять на состав исследуемой биосреды. Критерии исключения: иной возраст и несоответствие критериям включения. Исследование имело пилотный одноцентровый характер. Поскольку у части пациентов клинические факторы сочетались, исследование было ориентировано прежде всего на выявление направленности спектральных сдвигов, а не на строгую оценку независимого вклада каждого фактора.

Кариозный статус оценивали клинически с выделением групп без клинических признаков кариеса, с начальным кариесом и с множественным кариесом. Состояние десны характеризовали по наличию и степени выраженности воспалительных изменений как отсутствие клинически значимых изменений, воспалительные изменения легкой степени или воспалительные изменения средней степени. Сопутствующую соматическую патологию учитывали по данным анамнеза и медицинской документации. Для детального сопоставления спектральных профилей и их деконволюции были выделены четыре аналитические группы (таблица).

Отбор образцов десневой жидкости

Объектом исследования служила белковая составляющая десневой жидкости — сложной многокомпонентной биосреды, локально связанной с тканями зубодесневого интерфейса. Забор образцов проводили на кафедре детской стоматологии с ортодонтией Воронежского государственного медицинского университета имени Н. Н. Бурденко (Воронеж, Россия). Десневую жидкость отбирали в утренние часы без предварительной стимуляции с использованием микрокапилляров. Такой режим отбора минимизировал влияние циркадных колебаний и обеспечивал сопоставимость условий регистрации спектров [12]. После отбора образцы помещали в стерильные контейнеры и хранили при температуре 1–2 °C до спектроскопического анализа в рамках единого преаналитического режима.

ИК-Фурье-спектроскопия

ИК-спектры регистрировали методом синхротронной ИКФурье-спектроскопии с использованием вакуумированного спектрометра Bruker Vertex 80/v (Bruker Optik GmbH, Ettlingen, Germany) в диапазоне 3800–700 см^–1. В качестве основной аналитической области рассматривали полосу Амид III, поскольку она позволяет анализировать конформационные особенности белковой составляющей при меньшей методической зависимости от водного фона по сравнению с областями Амид I и Амид II [4, 8–10]. В исходном экспериментальном цикле применяли стандартные параметры регистрации: спектральное разрешение 4 см^–1, аподизацию Blackman–Harris 3-Term, фазовую коррекцию Mertz и коэффициент zero filling, равный 2. Содержимое каждого образца разделяли на десять порций, для каждой из которых регистрировали отдельный ИК-спектр; последующую характеристику спектрального профиля проводили по усредненным данным.

Предварительная обработка спектров и деконволюция

Первичная обработка ИК-спектров включала сглаживание кривых полиномом Савицкого–Голея второго порядка при размере окна 25 точек. Коррекцию базовой линии выполняли методом асимметричных наименьших квадратов в диапазоне 4000–500 см^–1 при пороговом значении 0,01 и факторе асимметрии около 0,001. Параметры предобработки подбирали так, чтобы уменьшить артефакты сглаживания и коррекции базовой линии при сохранении чувствительности к изменениям формы полосы Амид III.

Для количественного описания профиля полосы Амид III выполняли деконволюцию с выделением компонент, соотносимых с α-спиральными, β-складчатыми, β-поворотными и неупорядоченными конформациями. Для аппроксимации использовали гауссовы функции. Предварительный поиск центров тяжести и ширины полос на полувысоте проводили по вторым и четвертым производным сглаженных спектров. Дальнейшее моделирование выполняли в программе Fityk v.1.3.1 (разработчик M. Wojdyr, Польша) с использованием алгоритма Левенберга–Марквардта. Для сопоставимости результатов во всех образцах сохраняли одинаковое число компонент. При моделировании использовали boxограничения: для положений максимумов ± 2 см^–1, для значений FWHM — 7–10 см⁻¹. Критерием завершения аппроксимации служило наилучшее соответствие между теоретической и экспериментальной кривыми по критерию χ². Полученные компоненты рассматривали как спектрально-ассоциированные вклады, а не как прямое абсолютное измерение содержания соответствующих вторичных структур [4, 8–10]. Соотнесение компонент I–XII с элементами вторичной структуры белков проводили на основании ранее опубликованных данных по интерпретации полосы Амид III и диапазонов максимумов соответствующих ИК-полос [4, 8–10]. Выбранные boxограничения задавали в пределах, обеспечивавших устойчивость аппроксимации и соответствие литературным диапазонам положений максимумов и ширин полос для области Амид III [4, 8–10]. Одинаковое число компонент, единые box-ограничения и применение одинаковой схемы аппроксимации во всех образцах использовали для повышения воспроизводимости и сопоставимости результатов деконволюции.

Многомерный и статистический анализ

После предварительной обработки массив спектральных данных анализировали методом главных компонент для оценки взаимного расположения образцов в многомерном пространстве и интерпретации связей между спектральной вариабельностью и клиническими факторами. В качестве количественных переменных использовали интенсивности спектров в области полосы Амид III, а характеристики пациентов рассматривали как категориальные признаки, применяемые на этапе интерпретации. Для анализа использовали пакет FactoMineR в среде R, а для визуализации — пакет factoextra. На этом этапе определяли, какие клинические факторы в наибольшей степени связаны с основными направлениями спектральной вариабельности, и оценивали близость образцов в пространстве главных компонент. На этапе интерпретации дополнительно оценивали, как уровни категориальных клинических признаков соотносятся с положением образцов и основными направлениями спектральной вариабельности, выявленными методом главных компонент. Категориальные клинические признаки не включали в модель как независимые ковариаты; их использовали для клинической интерпретации распределения образцов в пространстве главных компонент, что соответствовало пилотному дизайну исследования.

На следующем этапе после выделения ключевых факторов вариабельности отбирали образцы для дальнейшей деконволюции спектральных профилей и проводили исследовательские попарные сравнения. Для этого использовали пакет BSDA и функцию tsum.test с поправкой Бонферрони на множественные сравнения. Анализ выполняли при уровне значимости 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Спектральный профиль полосы Амид III

В области полосы Амид III образцы десневой жидкости характеризовались сложным многокомпонентным контуром, формируемым перекрывающимися полосами различной конформационной принадлежности (рис. 1). Поэтому интегральная интенсивность была информативна лишь частично, тогда как более содержательным параметром оказалось перераспределение вкладов отдельных спектральных компонент внутри общего профиля. Основной вклад в интегральную интенсивность вносили компоненты, соотносимые с β-складчатыми структурами и неупорядоченными конформациями; вклад α-спиральных компонент был менее выражен [8–10]. По данным суммарной оценки основных элементов вторичной структуры (рис. 2), во всех четырех аналитических группах вклад β-складчатых компонент превышал 50%, вклад неупорядоченных конформаций составлял примерно 21–31%, тогда как вклад β-поворотов и α-спиральных компонент оставался менее 10–11%. Ключевые клинические характеристики аналитических групп приведены в таблице, а типичный профиль деконволюции — на рис. 1. На рис. 2 столбцы отражают средние значения суммарных вкладов, а вертикальные отрезки — вариабельность измерений. Данные многомерного анализа использовали для отбора четырех аналитических групп; выявленная спектральная неоднородность образцов в целом согласовывалась с направленностью сдвигов, установленной при последующей деконволюции полосы Амид III. В пространстве первых главных компонент наблюдалось частичное разграничение аналитических групп, что в целом не противоречило последующим различиям в суммарных вкладах β-складчатых компонент и β-поворотов.

Внутренние коды образцов представлены в таблице. Компоненты I–V в спектральном профиле соотнесены с β-складчатыми структурами, VI–VII — с неупорядоченными конформациями, VIII–IX — с β-поворотами, X–XII — с α-спиральными компонентами. Такое распределение также вынесено в поясняющий блок рис. 1 для облегчения интерпретации графического материала.

Спектральные сдвиги при кариесе

Наиболее устойчивой особенностью в пилотной выборке было направленное увеличение относительного вклада компонент, ассоциированных с β-складчатыми структурами, в образцах детей с кариесом. Суммарный вклад β-складчатых компонент в группах с кариесом достигал примерно 59–61% против около 53% в группе без клинически значимых стоматологических изменений (рис. 2). Этот сдвиг сохранял одно и то же направление при разных сочетаниях сопутствующих клинических признаков, хотя его величина менялась от сравнения к сравнению. В рамках настоящей работы такой результат корректно рассматривать не как диагностический критерий, а как кандидатный спектральный признак изменений белковой составляющей десневой жидкости [11, 13–14].

По своему направлению это наблюдение согласуется с данными литературы по ИК-Фурье-спектроскопии в области полосы Амид III у взрослых, где β-складчатые компоненты также описаны как наиболее устойчивый сдвиг, ассоциированный с кариесом [11, 13–14]. Однако совпадение направления не означает эквивалентности выводов: взрослая когорта и детская выборка различаются по возрасту, клиническому контексту и набору смешивающих факторов. Следовательно, речь идет о предварительной межисследовательской согласованности, а не о полноценной внешней репликации.

Спектральные сдвиги при воспалительных изменениях тканей пародонта

При воспалительных изменениях десны наблюдалась тенденция к уменьшению вклада β-поворотов и относительному увеличению неупорядоченных конформаций. В исследовательском наборе доля β-поворотов оставалась низкой и не превышала примерно 10%, тогда как вклад неупорядоченных конформаций находился в диапазоне около 21–24% для групп с воспалительными изменениями десны. С физикохимической точки зрения такой сдвиг может отражать изменение состава белковой составляющей, усиление протеолитической активности и повышение доли структурно менее упорядоченных белковых состояний в локальной воспалительно-ремоделирующей среде [2–3, 15].

Международные данные по анализу состава десневой жидкости с использованием методов молекулярной идентификации поддерживают эту общую логику: при развитии заболеваний пародонта образцы могут различаться по молекулярному профилю, а значимыми оказываются изменения цитокинов, металлопротеиназ и матриксных белков [2–3, 15–16]. В настоящем исследовании выявленные спектральные сдвиги следует трактовать как интегральный сигнал воспалительно-ремоделирующей среды, а не как характеристику отдельных таргетных белков или белковых панелей.

Сопутствующая соматическая патология

У части детей с сопутствующей соматической патологией регистрировалось уменьшение вклада α-спиральных компонент. Биологически такой сдвиг возможен, поскольку для различных заболеваний и состояний стресса в белковых образцах описывали соотношение типа «α-спираль / β-складчатая структура» [4, 17–18]. Однако с учетом малого объема выборки и сочетания клинических факторов этот результат следует трактовать как наблюдательную тенденцию, а не как доказанный самостоятельный эффект сопутствующей патологии. В контексте детской десневой жидкости ИК-Фурьеанализ следует рассматривать как интегральный метод молекулярного профилирования, а не как замену таргетным белковым панелям [4, 17–18]. Распределение вкладов основных элементов вторичной структуры белков представлено на рис. 2.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Полученные данные свидетельствуют о том, что профиль полосы Амид III в десневой жидкости следует рассматривать прежде всего как интегральную спектральную характеристику сложной белковой смеси, а не как прямое количественное измерение содержания отдельных вторичных структур. Поэтому интерпретация результатов должна учитывать ограничения, связанные с перекрыванием полос, схемой предварительной обработки и используемой моделью деконволюции [4, 8–10].

Направленное увеличение вклада β-складчатых компонент при кариесе согласуется с ранее описанными в работах по ИК-спектроскопии оральных биосред и расширяет эти результаты на педиатрическую выборку [11, 13–14]. Такая тенденция может отражать изменение соотношения более упорядоченных и менее упорядоченных белковых состояний в условиях локального кариозного процесса. В свою очередь, тенденция к снижению вклада β-поворотов и относительному росту неупорядоченных конформаций при воспалительных изменениях десны биологически правдоподобна и соответствует современным представлениям о перестройке молекулярного профиля десневой жидкости в воспалительно-ремоделирующей среде [1–3, 15–16].

Таким образом, многомерный анализ и деконволюция спектральной полосы Амид III в настоящей работе выполняли взаимодополняющие функции: PCA использовали для выявления общей спектральной неоднородности и отбора аналитических групп, тогда как деконволюция позволяла интерпретировать эту вариабельность через перераспределение вкладов компонент полосы Амид III. Такое согласование двух подходов повышает доказательность выявленных направленных сдвигов, хотя в силу пилотного дизайна не заменяет их дальнейшей клинической проверки.

Ограничения исследования

Интерпретация выявленных сдвигов ограничена пилотным объемом выборки, клинической неоднородностью наблюдений и зависимостью результатов деконволюции от алгоритмов предварительной обработки спектров [4, 8]. Кроме того, в детской выборке на состав десневой жидкости потенциально влияют возраст, стадия прикуса, гигиенический статус, ортодонтическая нагрузка и пубертатные изменения [5–7]. Дополнительными источниками вариабельности могли быть особенности преаналитического этапа, в том числе объем материала и временной интервал между забором и регистрацией спектров. Наконец, в настоящем пилотном исследовании сопутствующую соматическую патологию не анализировали как самостоятельный независимый фактор. Поэтому обнаруженные особенности следует рассматривать как гипотезо-генерирующие и требующие дальнейшей валидации на расширенном клинически стратифицированном материале. Дополнительным ограничением является то, что кариозный статус и выраженность воспалительных изменений десны в настоящей пилотной работе описывали исследовательской клинической стратификацией, а не развернутой индексной оценкой, что должно учитываться при интерпретации результатов.

ВЫВОДЫ

Анализ полосы Амид III десневой жидкости у детей 8–14 лет позволил выявить различия ИК-спектрального профиля белковой составляющей в зависимости от стоматологического статуса. В пилотной выборке кариес ассоциировался с увеличением вклада β-складчатых структур, а воспалительные изменения десны — с тенденцией к росту неупорядоченных конформаций и снижению вклада β-поворотов. Таким образом, анализ ИК-спектральной полосы Амид III может быть полезен как исследовательский подход для оценки молекулярных изменений в десневой жидкости, однако его клиническая значимость требует дальнейшего подтверждения.