Псориаз является хроническим дерматозом мультифакторной природы с доминирующим значением в его развитии генетических факторов [1]. Распространенность псориаза достаточно велика — в среднем 3 % всех заболеваний кожи и подкожной клетчатки, поэтому в настоящее время уделяется особое внимание наблюдению и лечению больных с данной патологией. Важную роль в патогенезе заболевания играют иммунные нарушения. Иммунная система кожи включает клеточные элементы, локализующиеся в эпидермисе и дерме, а также выделяемые ими гуморальные факторы (цитокины, ростовые факторы, гормоны). Большинство современных концепций патогенеза псориаза сфокусированы на повышении секреции провоспалительных цитокинов иммунокомпетентными клетками. Многие процессы, необходимые для поддержания целостности кожи, такие как антимикробная и противовирусная защита, заживление ран и противоопухолевый эффект, регулируются цитокинами [2]. В здоровой коже и слизистых оболочках наблюдается сбалансированное содержание про- и противовоспалительных цитокинов, что обеспечивает адекватный иммунный ответ на антигенную стимуляцию. Многочисленные исследования демонстрируют, что члены семейства интерлейкин-10 IL-10 (IL-10, IL-19, IL-20, IL-22, IL-24, IL-26) цитокинов являются важными регуляторами некоторых из этих процессов [2]. Взаимодействие раз- личных типов иммунокомпетентных клеток, опосредованное цитокиновым каскадом Th-1, Th-17 и Th-22 типов, приводит к формированию характерного псориатического фенотипа.
В ряде исследований показана роль генетических поли- морфизмов и мутаций цитокинов и цитокиновых рецепторов, а также компонентов их сигнальных путей в патогенезе псориаза [3–7]. При анализе полиморфных вариантов гена IL10 (–1082 A/G, –819 C/T, –592 C/A) установлена ассоциация гаплотипа АСС с повышенной секрецией IL–10, тогда как гаплотипа АТА — с пониженной [3]. К. Kingo и соавт. идентифицировали, что аллель G rs2981572 гена IL20 (р <0,05) является маркером повышенного риска развития псориаза в эстонской популяции [4]. Кроме того, наблюдается повышенная частота гаплотипа HT3 GAA (OR = 2,34, 95 % CI 1,34–4,07, р <0,01) у больных бляшечным псориазом по сравнению с контрольной группой. S. Koks и соавт. обнаружили, что пациенты с бляшечным псориазом имели более высокую частоту гаплотипа НТ3 CACCGGAA генов IL19 и IL20 по сравнению с контрольной группой. Таким образом, данный гаплотип маркирует повышенный риск развития заболевания в эстонской популяции (OR = 2,5, 95 % CI 1,37–4,70, p <0,01) [5], тогда как гаплотип САААС генов IL20 и IL24 показал протективный эффект (OR = 0,15, p <0,05) [6]. Также гаплотип НТ3 CACCGGAA был ассоциирован с ранним (OR = 2,2, 95 % CI 1,31–4,21, p <0,02) и поздним (OR = 2,4, 95 % CI 1,12–5,40, p <0,02) началом заболевания, семейной (OR = 2,4, 95 % CI 1,19–4,90, p <0,02) и спорадической (OR = 2,8, 95 % CI 1,47–5,60, p <0,01) формами псориаза [5]. Э. Галимова и соавт. установили, что аллель C и гаплотип СС rs30461 гена IL29 маркирует пониженный риск развития псориаза у русских [7].

При молекулярно-генетических исследованиях любого многофакторного признака принципиально важным является учет этнической принадлежности обследованных лиц. Генетическая структура этноса включает сумму частот самых разных генов, а частота того или иного генотипа является результатом отбора по какому-либо признаку, зависящему от социально-демографических, климатических и прочих факторов. Изменения в генах, кодирующих интерлейкины, имеют большое значение для активации иммунокомпетентных клеток и, следовательно, развития патологических изменений в эпидермисе. Идентификация специфичных генов, вовлеченных в патогенез псориаза, будет способствовать формированию фундаментальных представлений о генетических, иммунных и патогенетических аспектах псориаза. Как следствие, понимание генетических механизмов развития заболевания имеет существенное значение для определения подходов к профилактике псориаза в семьях высокого риска и для разработки оптимальных и эффективных методов терапии. Целью настоящего исследования стало изучение ассоциаций полиморфного варианта rs1554286 (+1547 C/T) гена IL10 с риском развития псориаза у русских Волго-Уральского региона.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Использованы образцы ДНК 273 больных псориазом, состоящих на учете и находящихся на стационарном лечении в Республиканском кожно-венерологическом диспансере г. Уфы Республики Башкортостан (табл. 1). Выборку больных составили неродственные между собой пациенты в возрасте от 7 до 93 лет русской этнической принадлежности. Клиническое обследование включало сбор жалоб и анамнеза, физикальные, лабораторные и инструментальные методы. В диагностике псориатического артрита использовали критерии CASPAR (Классификация критериев псориатического артрита — ClASsification criteria for Psoriatic ARthritis), рентгенографическое исследование суставов и позвоночника, а также анализ крови для выявления ревматоидного фактора и исключения ревматоидного артрита. Контрольная группа была сформирована из 298 здоровых неродственных лиц, соответствующих группе больных по возрасту, полу и этнической принадлежности. Взятие крови проводили на станциях переливания крови у здоровых доноров, отрицавших наличие псориаза и других аутоиммунных заболеваний у себя и родственников.

ДНК выделяли из лимфоцитов периферической крови методом фенольно-хлороформной экстракции [8]. Генотипирование выборки больных псориазом и здоровых доноров по полиморфному локусу rs1554286 гена IL10 осуществляли методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) с использованием CFX 96™ Real-Time Cycler (BioRad, США). ПЦР синтеза ДНК провели в 10 мкл общего объема смеси, содержавшей 2 мкл универсального буфера (670 мМ Tris-HCl (pH 8,8); 0,1 % Tween-20, 2 мМ dNTPs, 10 мМ праймеров, 5 мМ зондов), 0,2 мкл Taq-полимеразы и 30 нг геномной ДНК. Использовали следующие праймеры:
FJ, 5'– TGTCCCAGAATGCAAGAA–3'; RJ,5' –CCCAGGTCCAGATGAAG– 3';FAM–tgctccccgcgtggc–BHQ–1; VIC–tgctccccccgtggc – BHQ–2. После ПЦР-РВ полиморфного локуса rs1554286 (+1547 C/T) гена IL10 провели анализ кривых флуоресценции по отдельным лункам в окне «Расчет» раздела «Анализ данных» и анализ распределения генотипов в окне «Аллельная дискриминация» согласно протоколу программы BioRad CFX Manager v 1.6 для BioRad CFX. О наличии того или иного аллеля полиморфного локуса судили по росту флуоресценции соответствующих красителей FAM и VIC. Соответствие наблюдаемого распределения частот генотипов теоретически ожидаемому равновесному распределению по закону Харди–Вайнберга оценивали с помощью точного критерия Фишера [9] в программе FINNETI. Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием пакета прикладных программ PLINK, FINNETI и MS Excel 2013 (Microsoft). При сравнении частот аллелей и генотипов в группах больных и здоровых лиц применяли критерий X2, точный критерий Фишера и критерий X2 с поправкой Йетса для таблиц сопряженности 2x2. Силу ассоциаций генотипических характеристик c риском развития псориаза оценивали по значениям показателя отношения шансов (odds ratio, OR).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В ходе исследования был проведен анализ ассоциаций поли- морфного варианта rs1554286 (+1547 C/T) гена IL10 семейства цитокинов интерлейкина-10 с риском развития псориаза у русских Волго-Уральского региона. Сравнение распределения частот аллелей и генотипов однонуклеотидного полиморфизма (SNP, single nucleotide polymorphism) rs1554286 гена IL10 между группой больных псориазом и контрольной группой в целом, а также c учетом степени тяжести псориаза (легкая и тяжелая) и времени манифестации болезни (I тип — до 40 лет, II тип — после 40 лет) показало статистически значимые различия (р <0,05) (табл. 2). В группе больных псориазом обнаружена ассоциация аллеля T (OR = 0,72, 95 % CI 0,54–0,96) rs1554286 гена IL10 с пониженным риском развития заболевания. Установлено также, что аллель Т rs1554286 гена IL10 (OR = 0,54; 95 % CI 0,30–0,97) маркирует пониженный риск развития заболевания у больных с тяжелым течением псориаза. Кроме того, носительство аллеля Т и гетерозиготного генотипа С/Т rs1554286 гена IL10 понижает риск развития заболевания у больных псориазом I типа (OR = 0,69; 95 % CI 0,51–0,95; OR = 0,63; 95 % CI 0,43–0,93 соответственно). Таким образом, в результате проведенного исследования идентифицирован полиморфный локус rs1554286 гена IL10 как маркер пониженного риска развития псориаза у русских Волго-Уральского региона.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Настоящим исследованием установлено, что полиморфный локус rs1554286 гена IL10 показал протективный эффект при тяжелом течении и ранней манифестации псориаза у русских Волго-Уральского региона. Изученный полиморфный вариант rs1554286 гена IL10 представляет собой изменение на границе экзона и интрона, которое, возможно, приводит к изменениям процесса сплайсинга. Данный вид мутаций часто нарушает процессинг первичного РНК-транскрипта, в результате чего происходят либо неправильное вырезание соответствующей интронной области и трансляция бессмысленного удлиненного белка, не защищенного от протеолитического действия внутриклеточных ферментов, либо вырезание экзонов и образование делетированного белка.

IL-10 состоит из 160 а. о. Ген IL10 картирован на хромосоме 1 (участок 1q31–32), содержит 5 экзонов. Нет литературных данных об ассоциациях полиморфного локуса rs1554286 гена IL10 с псориазом в других популяциях мира, таким образом, это первые данные, демонстрирующие роль этого полиморфизма в патогенезе псориаза. Исследование и понимание роли IL10 в патогенезе псориаза имеет практическое значение для новой иммунотерапии данного заболевания. IL-10 подавляет функциональную активность макрофагов, ингибирует продукцию моноцитами и макрофагами провоспалительных цитокинов и хемокинов, включая TNF-Į, IL-1, IL-6, IL-8, IL-12. IL10 повышает синтез IL-1Ra, который, ингибируя антигенспецифическую активацию, пролиферацию и продукцию цитокинов Т-лимфоцитами, снижает антигенпрезентирующую способность моноцитов, связанную с регулирующими молекулами HLA II класса и экспрессией молекулы В7 на их поверхности. Вместе с тем IL-10 определяет переход Th0 в Th2, тем самым стимулируя пролиферацию В-лимфоцитов и секрецию иммуноглобулинов. Предполагается, что IL-10 проявляет свою антипсориатическую активность путем воздействия на различные клеточные популяции, включая Т-клетки и антигенпрезентирующие клетки (APCs).

Учитывая биологическую роль этого цитокина, можно пред- положить его возможное влияние на предрасположенность к аутоиммунным и воспалительным заболеваниям. Многочисленные исследования демонстрируют роль полиморфного локуса rs1554286 гена IL10 в патогенезе иммуновоспалительных, инфекционных и онкологических заболеваний, таких как ревматоидный артрит, системная красная волчанка, болезнь Бехчета, гемофильная инфекция, доброкачественная гиперплазия предстательной железы [10–18]. В корейской популяции была изучена роль цитокинов IL10, IL10RA и IL10RB в патогенезе доброкачественной гиперплазии предстательной железы [10]. Показана статистически значимая (р <0,05) ассоциация полиморфного варианта rs1554286 гена IL10 с объемом предстательной железы: аллель C, кодоминантная и доминантная модели наследования rs1554286 гена IL10 ассоциировали с показателями объема простаты. При изучении роли полиморфных вариантов генов Mal/TIRAP и IL10 в патогенезе заболеваний, вызванных гемофильной палочкой серотипа b, у ранее вакцинированных детей была обнаружена ассоциация rs1554286 IL10 c эпиглоттитом T (OR = 5,8; 95 % CI 2,4–14,2), тогда как среди больных менингитом и другими инфекциями, вызванными гемофильной палочкой, эта ассоциация не наблюдалась [11]. Индийские ученые S. Aggarwal и соавт. исследовали ассоциацию 51 SNPs противовоспалительных цитокинах и их рецепторах с предрасположенностью к проказе в популяции Северной Индии с последующей репликацией ассоциированных SNPs в географически близкой популяции Восточной Индии. Статистически значимая (р <0,05) ассоциация с проказой была выявлена для 8 полиморфных локусов (rs1800871, rs1800872 и rs1554286 IL10; rs3171425 и rs7281762 IL10RB; rs2228048, rs744751 TGFBR2 и rs1800797 IL6). В дальнейшем эта ассоциация была реплицирована и подтверждена для 4 полиморфных вариантов (rs1554286 IL10, rs7281762 IL10RB, rs2228048 TGFBR2 и rs1800797 IL6). Таким образом, было показано, что полиморфный вариант rs1554286 гена IL10 маркирует повышенный риск развития проказы в обеих изученных популяциях Северной и Восточной Индии (OR = 1,66 и 1,55; 95 % CI 1,30–2,14 и 1,24–1,95 соответственно) [12].

Японские ученые N. Mizuki и соавт. при проведении полногеномного исследования ассоциаций (Genome-Wide Association Studies — GWAS) идентифицировали гены предрасположен- ности к болезни Бехчета IL23R, IL12RB2 и IL10. Ими была об- наружена ассоциация полиморфного варианта rs1554286 гена IL10 с этим заболеванием в японской популяции (р <0,001) [13].

Установлено, что полиморфизмы IL10-592 и IL10-1082 ассоциированы с системным ювенильным идиопатическим артритом [14]. Группой английских ученых было проведено исследование полиморфизмов промоторной области гена IL10 у 500 пациенток с раком молочной железы и 500 здоровых женщин из Германии. Показано, что гомозиготы по гаплотипу ATA G(–1082)/A/C(–819)T/C(–592)A встречаются почти в 2 раза чаще, чем в контрольной группе (7,3 и 4,2 % соответственно) [15]. При сравнении частот аллелей полиморфизма IL10 C–592A у 264 пациентов с раком толстой кишки и 408 здоровых жителей северо-восточной Шотландии было показано, что у носителей аллеля A в 2 раза снижен риск заболевания при постоянном приеме аспирина, чего не наблюдается у обладателей двух аллелей C [16]. Исследователи G. Xie и соавт. изучили концентрацию белка IL-10 в сыворотке крови больных с ишемическим инсультом (ИИ) и роль полиморфного варианта rs1554286 IL10 в патогенезе ИИ в китайской популяции (p <0,05) [17]. Было показано, что повышенный уровень белка IL-10 в сыворотке крови был статистически значимо ассоциирован с риском развития ИИ (OR = 0,50; 95 % CI 0,31–0,81). При рецессивной модели наследования (TT versus CC+CT) отмечен повышенный риск развития ИИ (OR = 1,54; р = 0,034). По результатам исследования А. Malarstig и соавт. больных c острым коронарным синдромом (ОКС) в Швеции установлено, что концентрация белка IL-10 в плазме крови была значительно выше в группе больных ОКС, чем у здоровых лиц [18]. При сравнении частот аллелей полиморфного локуса 1170 C>T гена IL10 между больными (ОКС) и контрольной группой не были выявлены статистически значимые различия.

ВЫВОДЫ

Полиморфный вариант rs1554286 гена IL10 играет в целом протективную роль в патогенезе псориаза. Учитывая значимость IL-10 в функционировании иммунной системы, можно предположить, что дальнейшие молекулярно-генетические и функциональные исследования полиморфных вариантов гена IL10 позволят раскрыть роль этого гена в развитии псориаза.