Заболевания лимфоглоточного кольца Вальдейра–Пирогова являются актуальной проблемой в детской оториноларингологии, [1, 2]. Отмечается тенденция к увеличению частоты встречаемости гипертрофии глоточной миндалины у детей, что в свою очередь ведет к увеличению количества оперативных вмешательств [3]. На вопрос, является ли приоритетным хирургический или консервативный метод лечения, по-прежнему нет однозначного ответа [4].
Гипертрофия аденоидных вегетаций (гипертрофия АВ) сопровождается частыми ОРВИ, нарушением носового дыхания, различными формами средних отитов. В лимфоидной ткани носоглотки формируется мукозальный иммунитет ЛОР-органов, и разработка и внедрение в клиническую практику молекулярно-генетических методов исследования врожденного иммунитета позволит сформулировать и научно обосновать новые подходы к иммунотропной терапии с учетом индивидуальных особенностей иммунной системы пациента.
В последние годы достигнуты успехи в изучении роли распознающих рецепторов врожденного иммунитета — Toll-подобных рецепторов (TLR) и их роли в патогенезе различных заболеваний человека [5, 6]. Распознавание патогенов и эндогенных лигандов TLR запускает активацию генов цитокинов, противомикробных пептидов (ПМП) и других молекул [5, 7]. Дефекты в системе TLR могут привести к развитию тяжелых инфекций, аутоиммунных заболеваний, аллергопатологий. Целью нашего исследования являлся анализ уровней экспрессии генов распознающих рецепторов (TLR2, TLR4, TLR9) и противомикробных пептидов (альфа-дефенсина — НBD1 и бета-дефенсинов — HBD2 и HNP1) у здоровых детей и у детей с гипертрофией аденоидных вегетаций.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Критериями для включения в исследование являлось наличие у детей в возрасте от 2 до 7 лет гипертрофии АВ II и III степени, отсутствие на момент исследования вирусной инфекции, острых воспалительных заболеваний и обострения хронических заболеваний, аллергопатологий, а также отсутствие аденоидита в течение месяца до начала исследования. Нами были обследованы 110 детей, находившихся на лечении в клинико-диагностическом центре и ЛОР-отделении Морозовской детской городской клинической больницы (г. Москва).
Пациенты с гипертрофией АВ были разделены на две группы в зависимости от клинических проявлений. В одну группу включили 39 пациентов, у которых преимущественно отмечалось затруднение носового дыхания, гнусавость, храп в ночное время, частые ОРВИ (группа I). Эти пациенты нуждались только в консервативной терапии. В другую группу включили 38 пациентов, у которых наблюдались частые острые средние отиты, экссудативные средние отиты, снижение слуха (группа II). У 95 % детей этой группы при эндоскопическом исследовании носоглотки определялся блок глоточных устьев слуховых труб. Этим детям произвели эндоскопическая аденотомию под интубационным наркозом. В контрольную группу включили 33 здоровых ребенка в возрасте от 2 до 7 лет I группы здоровья. Пациенты болели острыми вирусными заболеваниями не чаще чем 1–2 раза в год [8].
Всем пациентам было проведено эндоскопическое исследование полости носа и носоглотки жесткими и гибкими оптическими системами, которое позволяет оценить форму носоглотки и расположенной в ней лимфоидной ткани, пролабирование в задние отделы полости носа, предлежание к хоанам, ее расположение в носоглотке по отношению к глоточным устьям слуховых труб. Также была произведена тимпанометрия. Все пациенты были обследованы ЛОР-аллергологом для исключения аллергопатологии. Поскольку эпителий является полноправным участником системы врожденного иммунитета [9], в качестве клинического материала в работе использовали соскоб эпителиальных клеток слизистой полости носа, полученный с помощью «цитощеточки», тип D (для группы I и контрольной группы), а также соскоб со слизистой глоточной миндалины, полученный во время проведения эндоскопической аденотомии (для группы II). Получение и обработку клинического материала проводили в соответствии с методическими рекомендациями «Забор, транспортировка, хранение клинического материала для ПЦР-диагностики» Центрального НИИ эпидемиологии [10]. Для определения уровней экспрессии генов TLR и генов противомикробных пептидов выделяли РНК из биологического материала при помощи комплекта реагентов «РИБО-сорб» («ИнтерЛабСервис», Россия). Выделенную РНК использовали как матрицу для синтеза кДНК в реакции обратной транскрипции с использованием набора «Реверта» («ИнтерЛабСервис», Россия). На последнем этапе ставили полимеразную цепную реакцию в реальном времени (ПЦР-РВ). Последовательность праймеров для генов TLR2, TLR4, TLR9 и НBD1, НBD2, HNP1 подбирали с помощью программы Vector NTI 8.0, анализируя последовательности, полученные из электронной базы данных GenBank. Реакцию проводили в амплификаторе АНК-32 («Синтол», Россия). Все реакции проводили в строгом соответствии с протоколами фирм-производителей. Последовательность операций представлена на рис. 1. Статистический анализ проводили с использованием общепринятых статистических методов [11]. Полученные данные обрабатывали на персональном компьютере с помощью программ BioStat и Microsoft Excel. Для сравнения двух групп использовали критерий Манна–Уитни.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Анализ показателей врожденного иммунитета у пациентов с гипертрофией АВ II и III степени, которым было показано консервативное лечение (группа I), не выявил достоверных различий в уровнях экспрессии генов ТLR2, TLR4, TLR9 и НBD1, НBD2, HNP1 в сравнении с показателями контрольной группы. У детей группы II наблюдалось достоверное увеличение экспрессии генов TLR2, TLR4, отвечающих за распознавание бактериальных патогенов: экспрессия гена TLR2 была увеличена в 15,4 раза (p <0,05), TLR4 — в 10,3 раза (p <0,05) по сравнению с контрольной группой (рис. 2А).
Уровень экспрессии гена TLR9 в этой группе был ниже в 5 раз, гена HBD1 — в 33,4 раза, HBD2 — в 21 раз, HNP1 — в 3, 4 раза по сравнению с показателями контрольной группы (рис. 2Б).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Полученные для группы I данные представляются важными, так как в комплексе с другими методами обследования позволяют обосновать консервативное лечение гипертрофии аденоидных вегетаций. Отсутствие изменений в показателях врожденного иммунитета слизистой оболочки полости носа может явиться важным критерием для сохранения глоточной миндалины. Однако, сохраняя свою функцию, гиперплазированная лимфоидная ткань носоглотки в ряде случаев может быть причиной развития патологических изменений, носящих как местный характер (ринит, острый синусит, средний отит и др.), так и общий (нарушение обмена веществ, замедленный рост ребенка, гипоксия и др.) [1]. В этом случае следует применять хирургический метод лечения — аденотомию с помощью эндоскопической техники.
Выявлен дефект в механизмах защиты слизистой оболочки полости носа у детей группы II. Резкое увеличение уровней экспрессии генов TLR2 и TLR4 сочетается сниженной экспрессией генов эффекторных молекул противомикробных пептидов. Дисбаланс в распознающих и эффекторных молекулах врожденного иммунитета может быть одной из причин развития аденоидита, гипертрофии лимфоидной ткани носоглотки, которая в свою очередь может приводить к блоку глоточных устьев слуховых труб и средним отитам. Сниженная экспрессия гена TLR9 в группе II может свидетельствовать о дефекте противовирусной защиты слизистой оболочки, поскольку лигандами для рецептора TLR9 является ДНК вирусов. Выявленные изменения в показателях врожденного иммунитета слизистой оболочки полости носа могут служить дополнительными причинами проведения поднаркозной эндоскопической аденотомии.
Необходимо отметить, что уровень экспрессии изучаемых генов не различался по типу образца клинического материала (рис. 3). Наши результаты согласуются с данными Lеsmeister M., который выявил уровни экспрессии генов всех десяти Toll-подобных рецепторов в эпителии слизистой небных и глоточной миндалин [12]. В работе В. П. Быковой и соавт. с помощью иммуногистохимического метода продемонстрирована экспрессия генов TLR2, TLR4, TLR9 в эпителиальных структурах небных и глоточной миндалин, удаленных по поводу гипертрофии, хронического тонзиллита и хронического аденоидита [13]. По мнению этих авторов, TLR отводится ведущая роль в иммунологической защите слизистых ЛОР-органов.
На основании наших результатов можно представить схематически роль факторов врожденного иммунитета в патогенезе воспалительных заболеваний ЛОР-органов (рис. 4). Инфекционные агенты через активацию TLRs в клетках слизистой полости носа и лимфоглоточного кольца приводят к продукции эпителиальными клетками важных эффекторных молекул — дефенсинов [14]. Дефенсины, оказывая прямое противомикробное действие, защищают слизистые от патогенов [15]. Гиперэкспрессия генов TLR небезопасна для организма [16].

ВЫВОДЫ

Значительное увеличение уровней экспрессии генов TLR с одновременным снижением экспрессии генов противомикробных пептидов приводит к снижению защиты слизистых оболочек и может быть одной из причин развития аденоидитов и средних отитов. Это может быть дополнительным обоснованием хирургического метода лечения.