Пекарские дрожжи Saccharomyces cerevisiae являются чрезвычайно удобным объектом для исследования процессов, проходящих в митохондриях. У данного организма они имеют значительное функциональное сходство с человеческими, при этом дрожжи могут осуществлять жизнедеятельность в отсутствие функционально полноценных митохондрий, что позволяет делетировать гены тех или иных митохондриальных белков и изучать фенотипические проявления подобных мутаций. Митохондриальный геном S. cerevisiae представляет собой организованную в пространстве структуру, называемую нуклеоидом, содержащую до 10 копий мтДНК, которые взаимодействуют с различными белками. Митохондриальная ДНК в составе нуклеоида имеет трехмерную организацию, тесно связанную с механизмами репликации, транскрипции и наследования. Укладка в нуклеоид также защищает ДНК от атаки активных форм кислорода, появляющихся в ходе окислительного фосфорилирования [7].

Одним из наиболее широко представленных белков, взаимодействующих с мтДНК в нуклеоидах митохондрий дрожжей, является Abf2p. Впервые в чистом виде он был получен в 1979 г. [8], а наименование Abf2p было присвоено ему в 1991 г. [9]. Этот белок содержит в своем составе два домена — HMG1 (High-Mobility Group 1) и HMG2 (High- Mobility Group 2) — и на сегодняшний день исследован наиболее полно среди прочих белков митохондриального нуклеоида дрожжей.

Abf2p — это уникальный белок с самой высокой основ- ностью среди белков нуклеоида [10]. Он генерирует негативную суперспирализацию ДНК при контакте с кольцевой плазмидой в присутствии топоизомеразы 1 [10]. Дрожжи, мутантные по Abf2p, способны поддерживать мтДНК при росте на среде YPG, содержащей глицерин в качестве источника углерода. Однако при культивировании на средах со сбраживаемыми источниками углерода, например глюкозой, происходит постепенная потеря мтДНК [10]. Доказано также, что при мутации по гену Abf2p значительно снижается количество актов рекомбинации в митохондриях при спаривании со штаммом дикого типа [11]. Кроме того, Abf2p обеспечивает стабилизацию интермедиатов образования структуры Холлидея, что также указывает на важность этого белка в рекомбинации [12].

Несмотря на большое число работ, посвященных исследованию Abf2p, молекулярные механизмы его участия в процессах рекомбинации мтДНК остаются неизученными. Наличие в составе митохондриального ДНК-связывающего белка Abf2p двух HMG-доменов характерно для большинства белков семейства HMGB: известно, что они связываются с малой бороздкой ДНК с ограниченной специфичностью или же полностью неспецифичной [13]. Кроме того, предполагается, что HMG-домены, входящие в состав таких белков, связывают ДНК независимо друг от друга с близкой эффективностью [13]. Однако, по всей видимости, митохондриальные HMG-белки обладают значительно более широкой функциональностью, чем их ядерные гомологи. Так, митохондриальный ДНК-связывающий белок человека, TFAm, помимо функции компактизации нуклеоида, является транскрипционным фактором и, вероятно, участвует в процессах рекомбинации и репарации мтДНК [14]. Своей многофункциональностью, а также характеристиками связывания с ДНК TFAm сходен с бактериальными HU-белками [14]. Предполагается, что Abf2p также обладает мультифункциональными свойствами, поскольку является структурным аналогом TFAm в митохондриях дрожжей.

В данной работе мы получили рекомбинантные белки, соответствующие двум доменам Abf2p — HMG1 и HMG2, и изучили ДНК-связывающую способность этих доменов по отношению к линейному ДНК-дуплексу и структуре, имитирующей поздний интермедиат гомологичной рекомбинации — структуру Холлидея.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клонирование и экспрессия генов

Участки гена ABF2, соответствующие доменам HMG1 (аминокислотные остатки 27–115) и HMG2 (аминоксилотные остатки 112–183), амплифицировали с помощью пар праймеров abfhmg1F (GATACATATGGGTCCTAAAAGGCCC ACATC) / abfhmg1R (CGTCCTCGAGAGGAAGTTTTTCGTCA AACTCC) и abfhmg2F (GGCGCATATGGAGTTTGACGAAAAA CTTCC) / abfhmg2R (GAGGCTCGAGAGCATTATATTCTTGG ATAGC) соответственно. В качестве матрицы использовали геномную ДНК дрожжей штамма BW303. Полученные продукты амплификации обрабатывали эндонуклеазами рестрикции NdeI и XhoI (Thermo Fisher Scientific, США) и клонировали в составе экспрессионного вектора pET32a (Novagen, США). Таким способом были получены векторы pET32a_HMG1 и pET32a_HMG2. Соответствие клонированных последовательностей референсным подтверждали секвенированием по Сэнгеру в лаборатории постгеномных технологий НИИ физико-химической медицины ФМБА России. Полученными плазмидами трансформировали экспрессионный штамм Escherichia coli B834(DE3), отдельные колонии трансформантов переносили в жидкую среду 2xYT с 100 мкг/мл карбенициллина, культивировали при температуре 37 °С при интенсивном перемешивании до ОD600 ~ 0,6–0,8, после чего индуцировали экспрессию клонированных генов добавлением изопропил-β,D-галактотиопиранозида (IPTG) до концентрации 0,25 мМ, продолжали культивирование при температуре 30 °С в течение 3 ч. После этого клетки собирали центрифугированием (3000 g, 10 мин) и ресуспендировали в стартовом буфере (25 мМ Na-фосфатный буфер с pH 7,4; 500 мМ NaCl; 20 мМ имидазола). Ресуспендированные клетки разрушали ультразвуком в режиме 4 импульсов по 15 сек каждый при амплитуде 20 %, полученные клеточные лизаты центрифугировали при 17 000 g в течение 20 мин. Супернатанты, содержащие рекомбинантные белки, собирали и проводили дальнейшую очистку целевого продукта с помощью металл-хелатирующей хроматографии на колонке HisTrap объемом 1 мл, заполненной Ni-NTA сефарозой (GE Healthcare, США), с применением системы высокоэффективной хроматографии белков AKTA Purifier (GE Healthcare, США) согласно рекомендациям производителя. За элюцией целевых белков следили по поглощению при длине волны 280 нм. Фракцию с целевым белком сразу переводили в буфер для хранения (25 мМ Трис-HCl pH 7,4; 150 мМ NaCl; 5 мМ ЭДТА) с использованием колонки HiTrap Desalting объемом 5 мл, содержавшей сефадекс G-25. За эффективным переводом белка в буфер для хранения следили по соотношению пиков поглощения при длине волны 280 нм и проводимости раствора.