ISSN Print 2070–7320
ISSN Online 2070–7339
НАУЧНЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ ЖУРНАЛ РНИМУ ИМЕНИ Н. И. ПИРОГОВА
ОРИГИНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ
Стабильность гадолинийсодержащих магнитно-резонансных контрастных средств в присутствии ионов цинка и кальция в различных средах
Информация об авторах
1 Кафедра молекулярной фармакологии и радиобиологии им. П. В. Сергеева, медико-биологический факультет,
Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н. И. Пирогова, Москва
2 Лаборатория разработки методов и технологий лучевой терапии,Федеральный медицинский биофизический центр имени А. И. Бурназяна, Москва
3 Лаборатория радионуклидных и лучевых технологий в экспериментальной онкологии,Российский онкологический научный центр имени Н. Н. Блохина, Москва
Для корреспонденции: Шимановский Николай Львович
ул. Большая Пироговская, д. 9а, г. Москва, 119435; ur.xednay@nnnamihs
Информация о статье
Финансирование: работа выполнена в рамках государственного контракта № 11411.1008700.13.081 по ФЦП «Развитие фармацевтической и медицинской промышленности Российской Федерации на период до 2020 года и дальнейшую перспективу», утвержденной постановлением Правительства Российской Федерации от 17 февраля 2011 г. № 91.
Статья получена: 29.09.2015
Статья принята к печати: 12.10.2015
Опубликовано online: 05.01.2017
|
Известно, что при проведении магнитно-резонансных исследований широко применяют контрастные средства на основе гадолиния [1]. Хотя гадолиний находится в этих средствах в виде хелатных комплексов, нельзя забывать о том, что токсичность этого редкоземельного элемента в свободном виде сопоставима с таковой ртути и свинца [2], а стабильность магнитно-резонансных контрастных средств (МРКС), основанных на гадолинии, неодинакова и определяется двумя основными факторами: 1) химической структурой хелатора; 2) наличием в окружении ряда органических и неорганических лигандов, которые могут конкурировать за связывание с ионами Gd3+ или с хелатирующим соединением, способствуя высвобождению Gd3+.
Для пациентов с нарушением функции почек применение нестабильного контрастного средства может обернуться фатальными последствиями, так как свободный гадолиний, накапливаясь в тканях, может приводить к развитию нефрогенного системного фиброза [3, 4, 5].
Недавние исследования показали, что на T1-взвешенных томограммах без контрастирования у пациентов [6] или экспериментальных животных [7], которым ранее вводили линейные МРКС c низкой стабильностью, наблюдалась повышенная интенсивность сигнала в таких структурах головного мозга, как бледный шар и зубчатое ядро, что, вероятно, связано с депонированием в них ионов Gd3+. После введения макроциклических МРКС с высокой стабильностью такого «остаточного» усиления сигнала не наблюдалось. Известно также, что высвобождение гадолиния из МРКС зависит от присутствия различных ионов в окружающей МРКС среде [8]. В связи с этим комплексное исследование взаимодействия указанных факторов поможет пролить свет на динамику процесса высвобождения ионов Gd3+ из хелатного комплекса в различных средах, а также оценить риск назначения некоторых контрастных средств пациентам с почечной недостаточностью или с состояниями, сопровождающимися повышением концентраций ионов цинка и кальция в крови. Актуальным является и вопрос увеличения стабильности этих контрастных средств, например путем добавления вещества с выраженными комплексообразующими свойствами. К таким веществам может относиться поливинилпирролидон (ПВП), который обладает комплексообразующими и дезинтоксикационными свойствами [9].
Цель исследования — провести сравнительный анализ стабильности Gd3+-содержащих МРКС в присутствии ионов цинка, кальция и ПВП в воде, фосфатном буфере и сыворотке крови человека.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В экспериментах изучали линейные Gd3+-содержащие МРКС: димеглюминовую соль гадопентетовой кислоты («Mагневист» 0,5 М, Bayer, Германия); гадобеновую кислоту («Мультихэнс» 0,5 M, Bracco, Италия); динатриевую соль гадопентетовой кислоты + ПВП («Дипентаст» 0,125 М, ООО «ГК «Эпидбиомед», Россия); гадопентетата-β-циклодекстрин («Циклогадопентетат» 0,125 М, ООО «ГК «Эпидбиомед», Россия), — а также макроциклическое МРКС гадобутрол («Гадовист» 1 М, Bayer, Германия).
Стабильность контрастных средств оценивали методом протонной ЯМР-релаксометрии (Minispec mq 20, Bruker, Германия). Высвобождение гадолиния из хелатного комплекса приводит к изменению времен релаксации протонов среды [10]. Мы измеряли время релаксации Т1.
Анализ стабильности средств проводили в дистиллированной воде (pH = 6,0), фосфатном буфере и сыворотке крови (рН = 7,4). В опытах с цинком оценивали стабильность пяти МРКС: димеглюминовой соли гадопентетовой кислоты, гадобеновой кислоты, динатриевой соли гадопентетовой кислоты с ПВП, гадопентетата-β-циклодекстрина и гадобутрола, а в опытах с кальцием — только димеглюминовой соли гадопентетовой кислоты.
Для получения 0,2 М фосфатного буфера c pH 7,4 вначале были приготовлены водные растворы NaH2PO4 и Nа2HPO4 [11]. В работе использовали сыворотку крови, взятую у пациентов Государственного научного центра колопроктологии имени А. Н. Рыжих. Все доноры подписывали информированное согласие на использование их биологического материала в научных исследованиях при условии соблюдения их прав на неприкосновенность частной жизни и конфиденциальность. Кровь набирали в стерильные пробирки с активатором свертывания и разделительным гелем. Сыворотку получали путем центрифугирования крови при 1200 g в течение 10 мин, хранили в замороженном виде при температуре –20 °C в течение не более 10 дней. Предварительно (до замораживания) в образцах сыворотки определяли концентрацию альбумина на биохимическом анализаторе Spotchem EZ SР-4430 (Arkray Inc., Япония). Затем образцы сыворотки разбавляли фосфатным буфером до концентрации альбумина 10–4 М (близка к физиологической).
Для получения 200 мМ водного раствора ZnCl2 («Компонент-реактив», Россия) растворяли навеску 2,7 г в 100 мл дистиллированной воды. Конечная концентрация ZnCl2 в пробе составляла 2 мМ. При выборе конечной концентрации ZnCl2 мы опирались на исследование M. Taupitz и соавт. [12], где самые убедительные результаты были получены именно при такой концентрации хлорида цинка.
Концентрация исходного водного раствора CaCl2 («Компонент-реактив», Россия) составляла 200 мМ (2,2 г CaCl2 в 100 мл дистиллированной воды), конечная концентрация в пробе была 2 мМ. Исходный водный раствор ПВП (Kollidon 17 PF, BASF) готовили растворением 500 мг порошка ПВП в 1 мл дистиллированной воды.
Для оценки стабильности изучаемых МРКС готовили одновременно две пробы. Первая проба представляла собой раствор МРКС в концентрации 0,2 мМ. Измеряли время релаксации Т1 раствора МРКС (0,2 мМ) при температуре 40 °C (температура в камере для образца в МР-релаксометре). Затем в пробу добавляли раствор хлорида цинка (или хлорида кальция) до конечной концентрации 2 мМ и снова измеряли время релаксации. Далее пробу инкубировали в термостате при температуре 40 °C, повторные измерения Т1 проводили через 1, 2 и 24 ч. Вторая проба была аналогична первой, но в нее после внесения хлорида цинка (или хлорида кальция) дополнительно добавляли раствор ПВП (конечная концентрация — 10 мг/мл). Измерения времени релаксации в случае второй пробы проводили в те же сроки.
Все эксперименты для повышения достоверности результатов были повторены шестикратно. С помощью пакета программ Statistica v10 были рассчитаны средние значения и стандартные отклонения. Полученные данные имели нормальное распределение (во всех случаях проверки выборок с помощью теста Колмогорова–Смирнова величина p была значительно больше 0,05), поэтому статистическую значимость различий средних величин определяли с помощью t-критерия Стьюдента со значимым отличием при p < 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Влияние ионов цинка на стабильность МРКС
В дистиллированной воде в отсутствие ПВП время продольной релаксации T1 всех линейных МРКС после добавления хлорида цинка через сутки снизилось в среднем на 23–28 % (рис. 1). В случае димеглюминовой соли гадопентетовой кислоты показатель T1 снизился на 25,7 ± 0,6 %, а ее динатриевой соли — на 28,1 ± 0,7 %, в случае «Циклогадопентетата» (ЦГП) — на 22,0 ± 0,5 %, гадобеновой кислоты — на 24,8 ± 0,4 %. Для макроциклического гадобутрола время T1 достоверно не изменилось.
В фосфатном буфере без ПВП при добавлении хлорида цинка величина T1 всех линейных МРКС через сутки снизилась в среднем на 13–19 %. В пробе с димеглюминовой солью гадопентетовой кислоты отмечено снижение данного показателя на 18,1 ± 0,7 %, с динатриевой солью гадопентетовой кислоты и ПВП — на 19,3 ± 0,8 %, с ЦГП — на 12,8 ± 0,6 %, с гадобеновой кислотой — на 15,9 ± 0,5 %. В случае гадобутрола время T1 не претерпело значимых изменений (рис. 2). Наибольшее снижение T1 наблюдалось через 1 и 24 ч после добавления хлорида цинка, а не сразу после его добавления, как в предыдущей серии опытов, когда в качестве среды была выбрана дистиллированная вода.
После добавления ПВП к димеглюминовой соли гадопентетовой кислоты величина T1 снижалась всего на 7,9 ± 0,7 %, в случае динатриевой соли этой кислоты — на 12,3 ± 0,7 % (рис. 3). Таким образом, ПВП статистически значимо улучшил стабильность этих линейных МРКС в среднем на 10 и 7 % соответственно. ПВП повысил стабильность ЦГП на 13 %, при этом величина T1 через сутки оставалась без значимых изменений. В случае гадобеновой кислоты конечные величины T1 в присутствии и в отсутствие ПВП достоверно не различались. Не отмечено какого-либо влияния ионов цинка на время релаксации гадобутрола в фосфатном буфере в присутствии ПВП (так же, как и в его отсутствие).
В сыворотке крови без добавления ПВП величина T1 у линейных МРКС снижалась в среднем на 31–61 %, при этом наиболее значимое снижение происходило через 1 и 24 ч после внесения в пробы хлорида цинка (рис. 4). Лучшие показатели стабильности среди линейных МРКС наблюдались у ЦГП — снижение T1 в среднем было на 31,2 ± 0,3 %, худшие — у солей гадопентетовой кислоты: в случае димеглюминовой соли — на 61,2 ± 0,6 %, динатриевой соли — на 56,1 ± 0,1 %. В пробах с гадобеновой кислотой величина T1 снизилась на 50,2 ± 0,1 %, а в пробах с гадобутролом достоверного снижения T1 отмечено не было. ПВП слабо, но статистически значимо повышал стабильность гадобеновой кислоты (на 5 %), не оказывая влияния на стабильность других МРКС (рис. 5).
Влияние ионов кальция на стабильность МРКС
Под действием ионов кальция величина T1 гадопентетата димеглюмина в отсутствие ПВП в воде достоверно не изменилась, а в фосфатном буфере и сыворотке крови снизилась на 7,8 ± 0,7 % и 9,1 ± 1,1 % соответственно. Добавление ПВП привело к статистически значимому улучшению стабильности гадопентетата димеглюмина в буфере и сыворотке крови. В опытах с ионами кальция стабильность гадопентетата димеглюмина в воде в присутствии ПВП не изменилась, о чем свидетельствует постоянство значения T1.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Cогласно полученным результатам, время продольной релаксации T1 снижается во всех пробах с линейными МРКС при добавлении ионов цинка вне зависимости от присутствия ПВП. Уменьшение величины T1 можно объяснить реакцией трансметаллизации между цинком и молекулой МРКС: ионы цинка замещают ионы гадолиния в хелатном комплексе, а в свободном виде ион гадолиния способен в большей степени укорачивать время релаксации протонов среды. На стабильность макроциклического гадобутрола ионы цинка не повлияли.
Наши результаты, указывающие на более высокую стабильность макроциклических МРКС, подтверждают литературные данные о диссоциации гадолиния в условиях in vivo при использовании линейных, но не макроциклических МРКС [13], а также данные о том, что цинк в результате трансметаллизации вызывает высвобождение гадолиния из хелатов линейных, но не макроциклических МРКС [12].
В сыворотке, разбавленной буфером до концентрации альбумина 10–4 М, за сутки величина T1 снижалась в большей степени, чем в двух других средах. Видимо, это связано с тем, что в сыворотке содержится большое количество соединений, способных взаимодействовать как с положительно заряженными ионами Gd3+ (фосфат, цитрат, карбонат, гепарин и др.), так и с отрицательно заряженным хелатом (катионы металлов), что в итоге приводит к дестабилизации большего числа молекул МРКС и созданию большей концентрации свободного гадолиния по сравнению с другими средами. В результате в опытах с сывороткой крови T1 снижается наиболее выраженно.
Сопоставление результатов, полученных в опытах с ионами цинка и кальция, показало, что влияние последних на стабильность гадопентетата димеглюмина проявляется в меньшей степени.
В фосфатном буферном растворе ПВП в отличие от водного раствора статистически значимо увеличил стабильность трех изучаемых линейных МРКС. В связи с этим следует рассмотреть вопрос о целесообразности включения ПВП в качестве вспомогательного компонента в состав лекарственных форм линейных МРКС.
Пациентам с почечной недостаточностью, у которых период полувыведения МРКС увеличен [14], следует избегать назначения линейных препаратов, особенно неионных, уступающих по стабильности макроциклическим. Эта рекомендация актуальна и для пациентов с состояниями, сопровождающимися повышенной концентрацией цинка и фосфатов в крови.
ВЫВОДЫ
Макроциклическое средство гадобутрол обладает большей стабильностью, чем все изученные линейные магнитно-резонансные контрастные средства, и ионы цинка не оказывают влияния на его релаксационные свойства. Линейные МРКС в присутствии ионов цинка наиболее стабильны в фосфатном буфере, наименее — в сыворотке крови. Поливинилпирролидон способен статистически значимо, но в небольшой степени улучшать стабильность линейных МРКС в фосфатном буфере (соответственно гадопентетата димеглюмина — на 10 %, динатриевой соли гадопентетовой кислоты — на 7 %, ЦГП — на 9 %) и в сыворотке крови (гадобеновой кислоты — на 5 %), но не в воде. Ионы кальция обладают значительно менее выраженным дестабилизирующим действием на гадопентетат димеглюмина, чем ионы цинка.