Нейротоксичность Aβ(25–35) при его введении в гиппокамп была показана Rush и соавт. [3]. Инъекция Aβ(25–35) приводила к разрушению близлежащей ткани и дегенера- ции нейронов [3]. Тем не менее другие авторы [4] не обнаружили нейротоксического действия Aβ(25–35) при его введении в область вентрального бледного шара и безымянной субстанции. Они наблюдали лишь образование полостей, содержавших белковые агрегаты, которые окрашивались конго красным. Агрегированный Aβ(25–35) вызывал более выраженные повреждения пирамидного слоя поля СА1 гиппокампа по сравнению с пептидом, который был синтезирован из тех же аминокислот в обратной последовательности — Aβ(35–25) [5, 6, 7, 8]. Дегенерирующие нейроны были также обнаружены в височной коре после инъекции Aβ(25–35) в крупноклеточное базальное ядро мозга крыс [9]. Следует отметить, что введение ундекапептида в отдельные структуры мозга может вызывать развитие транссинаптических нарушений цитоскелета и активацию астроглии, которые наблюдаются не только в участке непосредственного введения, но и распространяются к более отдаленным областям мозга. Такие изменения наблюдали, например, в гиппокампе после введения Aβ(25–35) в миндалину [10]. В нашей предыдущей работе Aβ(25–35) также вызывал активацию астроцитов и микроглии в гиппокампе при его введении в эту структуру [8].

Активация нейроглии в очаге повреждения может иметь двоякое значение. С одной стороны, как непосредственные участники нейровоспаления, активированные астроциты и микроглиоциты способствуют дегенерации. Механизмы нейровоспаления, будучи инициированными, могут сами по себе приводить к дисфункции и гибели нейронов, что вызывает дополнительное усиление воспаления. Тем самым замыкается порочный круг, в котором нейровоспаление выступает причиной нейродегенерации [11]. С другой стороны, активация глии является выраженным компенсаторным ответом ткани, при котором микроглия активно фагоцитирует патоген, вызвавший повреждение ткани, например введенный Aβ или компоненты амилоидных бляшек, а астроциты могут способствовать лучшему обеспечению нейронов веществами, необходимыми для репарации, такими как нейротрофины.

Один из важнейших нейротрофинов в мозге млекопитающих — это фактор роста нервов (nerve growth factor, NGF). NGF является главным нейротрофином, обеспечивающим поддержку и функционирование холинергических нейронов в мозге взрослых млекопитающих [12, 13]. Он синтезируется и выделяется во внеклеточную среду клетками гиппокампа и неокортекса — мишенями холинергических нейронов базальных ядер. В свою очередь холинергические нейроны в мозге молодых, взрослых и стареющих животных экспрессируют высокоаффинный рецептор TrkA и низкоаффинный — p75NTR для NGF [14], что демонстрирует зависимость метаболизма этих клеток от уровня нейротрофинов не только в развивающемся, но и в зрелом мозге. Особое значение сигнальный каскад, запускаемый NGF, приобретает в условиях развития болезни Альцгеймера. На начальных этапах болезни (при мягком когнитивном снижении) происходит уменьшение уровня NGF [15], тогда как более поздние стадии с выраженной деменцией связаны с его увеличением [15, 16]. Учитывая специфическую роль, которую Aβ может играть на разных стадиях заболевания, вероятно, что он прямо или косвенно вовлечен в регуляцию метаболизма NGF при болезни Альцгеймера.

Целью настоящей работы было исследование изменений в системе сигналинга NGF в гиппокампе крысы после введения агрегированного Aβ(25–35).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эксперименты с животными выполнены в соответствии с требованиями Директивы 2010/63/EU Европейского парламента и совета Европейского союза от 22.09.2010 и Приказа Минздрава России от 19.06.2003 № 267 в области защиты и использования животных в экспериментальных исследованиях. Протокол эксперимента утвержден Этической комиссией Института высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН.

Работа проведена на самцах крыс линии Wistar из питомника «Столбовая» Научного центра биомедицинских технологий ФМБА (Московская обл., Россия) массой 290–350 г. Крыс содержали по пять особей в пластмассовых клетках в условиях вивария при искусственном 12-часовом (8:00 — 20:00) световом режиме и свободном доступе к воде и пище.

Крыс анестезировали внутрибрюшинной инъекцией хлоралгидрата (350 мг/кг). Введение водных растворов Аβ(25–35), контрольного пептида, синтезированного из тех же аминокислот в обратной последовательности Аβ(35–25) и растворителя (стерильной воды) проводили в стереотаксисе Model 900 (David Kopf Instruments, США) билатерально в гиппокамп по следующим координатам: расстояние от брегмы AP –3,8 мм; L ± 2,0 мм; DV +3,8 мм [17]. Крысам вводили по 3 нмоль предварительно агрегированного Аβ(25–35) или Аβ(35–25) (Bachem, Switzerland) в объеме 2 мкл (1,5 нмоль/мкл), контрольным крысам — равный объем стерильной воды. Введение веществ осуществляли со скоростью 1 мкл/мин. Иглу шприца оставляли на месте инъекции в течение 5 мин для распределения введенного препарата и предотвращения его обратного вытекания. Агрегацию пептида проводили, как описано в работе [18].

Через 7 дней после операции крыс декапитировали, мозг вынимали, промывали в ледяном 0,9 % растворе NaCl и на льду выделяли гиппокамп и кору больших полушарий. Структуры мозга замораживали и хранили при –85 °С до анализа. Для измерения содержания NGF ткань гомогенизировали в соотношении 1 : 10 (масса/объем) в буфере, состоявшем из 100 мM Tris-HCl, pH 7,0, 2 % бычьего сывороточного альбумина, 1 M NaCl, 4 мM Na2EDTA, 2 % Triton X-100, 0,1 % NaN₃ и ингибиторов протеаз — 157 мкг/мл бензамидина, 0,1 мкг/мл пепстатина A и 17 мкг/мл PMSF.

Общее содержание NGF оценивали с помощью набора рективов для твердофазного иммуноферментного анализа ChemiKine Nerve Growth Factor Sandwich ELISA Kit (Merck Millipore, США) согласно инструкции производителя. Измерения проводили на многофункциональном ридере Wallac VICTOR 1420 (PerkinElmer, Финляндия). Концентрацию белка в ткани измеряли с помощью красителя кумасси ярко-синего G-250. Содержание NGF выражали в пг/мг белка.

Для гистологического или иммуногистохимического анализа крыс реанестезировали хлоралгидратом (450 мг/кг). После этого мозг фиксировали интракардиальной перфузией 4 % раствора параформальдегида в 0,1 М фосфатном буфере (pH 7,4). Мозг дофиксировали в том же фиксаторе в течение 24 ч. Фронтальные срезы толщиной 50 мкм изготавливали на вибрационном микротоме VT1200 S (Leica Biosystems, Германия) и хранили при –20 °С в криопротекторе. Срезы окрашивали крезил-виолетом (Merck, Германия) по методу Ниссля. Экспрессию рецептора p75NTR определяли на свободно плавающих срезах иммуногистохимически с использованием поликлональных антител кролика (Sigma-Aldrich, США) в разведении 1 : 100. Связывание антител выявляли с помощью антител козы к IgG кролика, конъюгированных с биотином (Sigma-Aldrich, США) в разведении 1 : 800, и авидин-биотинового комплекса с пероксидазой хрена VECTASTAIN Elite ABC Kit (Vector Laboratories, США). В качестве хромогена использовали диаминобензидин (SIGMA Fast kit; Sigma-Aldrich, США).