Свободные радикалы, образующиеся в организме, нарушают структуру мембран клеток, что, в свою очередь, ведет к развитию различных патологических состояний [1]. Разрушающее окислительное воздействие радикалов предупреждает система антиоксидантной защиты организма, в которой важную роль играют низкомолекулярные соединения — перехватчики (ловушки) радикалов. Одним из источников антиоксидантов является лекарственное растительное сырье [2], а также препараты на его основе, изучение антиоксидантного потенциала которых помогает повысить их профилактико-терапевтический эффект.

Основные методики определения антиоксидантов рассмотрены в работах [3, 4, 5, 6, 7, 8], однако определение антиоксидантов как химических соединений не дает полного представления о защитных свойствах изучаемого объекта: они обусловливаются не только количеством того или иного антиоксиданта, но также активностью каждого из них. Активность антиоксиданта, или антиоксидантная активность, АОА, — это константа скорости реакции антиоксиданта со свободным радикалом (kInH). Метод хемилюминесценции (ХЛ) позволяет определять общее количество радикалов, которое связывают антиоксиданты в образце (общую антиоксидантную емкость, ОАЕ), а при использовании метода математического моделирования кинетики ХЛ — также скорость образования и реакции радикалов с антиоксидантами, то есть АОА [9, 10, 11].

Наиболее распространенная модификация хемилюминесцентного метода определения общей антиоксидантной емкости основана на применении люминола в качестве активатора хемилюминесценции [12, 13, 14, 15]. В кювету хемилюминометра помещают образец с добавлением люминола, пероксида водорода и соединения, способного образовывать радикалы в результате спонтанного распада (термолиза), например 2,2’-азобис-(2-амидинопропан) дигидрохлорида (АБАП): АБАП → 2R•. В присутствии молекулярного кислорода алкильный радикал R• образует пероксильный радикал ROO•: R• + O₂ → ROO•. Далее пероксильный радикал окисляет хемилюминесцентный зонд люминол (LH₂), и образуется радикал люминола (LH•): ROO• + LH₂ → ROOH + LH•. Из LH• через образование промежуточных веществ (гидропероксида люминола и эндопероксида люминола) образуется молекула конечного продукта окисления люминола, аминофталевой кислоты, в электронно-возбужденном состоянии, которая высвечивает фотон, и в результате наблюдается хемилюминесценция [9]. Интенсивность ХЛ пропорциональна скорости образования фотонов, а она, в свою очередь, пропорциональна стационарной концентрации LH• в системе. Взаимодействуя с радикалами, антиоксиданты прерывают описанную цепочку превращений и препятствуют образованию фотона.

Соединения, подверженные термолизу, — не единственный возможный источник радикалов при анализе антиоксидантной емкости образца хемилюминесцентным методом. Альтернативами являются системы пероксидаза хрена–перекись водорода [13, 16], гемин–пероксид водорода [8], цитохром с–кардиолипин–пероксид водорода [11] и др. Схема реакций окисления люминола пероксидазами рассмотрена в работе Cormier и соавт. [17].

Кинетические кривые ХЛ для этих систем отражают две стадии реакции: стадию увеличения интенсивности ХЛ и стадию плато или постепенного спада свечения, когда интенсивность ХЛ либо постоянна, либо медленно снижается. В работе [15] описаны два подхода к измерению общей антиоксидантной емкости, учитывающие эту особенность кривых. Метод TRAP (Total Reactive Antioxidant Potential) основан на измерении латентного периода ХЛ τ и может быть использован для определения таких антиоксидантов, как тролокс или аскорбиновая кислота: они характеризуются высоким значением константы скорости реакции с радикалами и по этой причине могут быть названы сильными антиоксидантами [11]. В течение латентного периода происходит их полное окисление. Методом TAR (Total Antioxidant Reactivity) измеряют степень тушения хемилюминесценции q на плато или в максимуме хемилюминесцентной кривой: формула, где I — интенсивность хемилюминесценции без антиоксиданта, а I₁ — интенсивность ХЛ в присутствии антиоксиданта. Этот метод используется, если в системе присутствуют преимущественно слабые антиоксиданты с низкими константами скорости взаимодействия с радикалами — намного более низкими в сравнении с константой люминола [11].

Действие антиоксидантов характеризуют не только показателями τ и q. Как видно из работ [8, 11], действие таких антиоксидантов, как мочевая кислота в системе гемин–H₂O₂–люминол или токоферол, рутин и кверцетин в системе цитохром с–кардиолипин–H₂O₂–люминол, характеризуется изменением максимальной скорости нарастания ХЛ (v_max). Как показывают результаты математического моделирования кинетики, значения констант скорости взаимодействия этих антиоксидантов с радикалами близки к значению константы люминола, поэтому такие антиоксиданты могут быть названы антиоксидантами средней силы [11].

Если бы изучаемый материал, в частности растительное сырье, содержал только один тип антиоксидантов, то их содержание можно было бы характеризовать одним из трех перечисленных выше показателей (τ, q или v_max). Но в растительном сырье содержится смесь антиоксидантов разной силы. Чтобы решить эту проблему, некоторые авторы [8, 18, 19, 20] использовали изменение светосуммы хемилюминесценции за определенное время ∆S, рассчитанное по формуле, где ∆S₀ и ∆S_S — светосуммы ХЛ за заданное время t в контрольном и исследуемом образцах соответственно. Время должно быть достаточным для окисления всех антиоксидантов в системе, то есть для выхода кривой ХЛ исследуемого образца на уровень кривой ХЛ контрольного образца. Последнее предполагает, что исследователи должны не только регистрировать светосумму свечения, но и записывать кривую кинетики ХЛ в течение достаточно длительного времени, что делают далеко не всегда.

Поскольку все измеряемые показатели зависят от прибора и условий измерения, антиоксидантный эффект вещества в исследуемой системе обычно сравнивают с эффектом антиоксиданта, принятого за стандарт, например тролокса [8, 21].

Система пероксидаза хрена–пероксид водорода применялась для анализа общей антиоксидантной емкости растительного сырья многими авторами. В работах [22, 23] для оценки количества антиоксидантов в образцах использовали латентный период ХЛ (метод TRAP), а в работах [18, 19, 20] — площадь под кривой развития ХЛ. Однако в перечисленных работах не дано четкого обоснования выбора того или иного параметра для оценки ОАЕ.

Целью исследования было определить, как соотношение антиоксидантов различного типа влияет на ОАЕ, и модифицировать метод хемилюминесценции таким образом, чтобы иметь возможность точнее определять ОАЕ в растительном сырье. Для этого мы поставили перед собой несколько задач. Во-первых, сравнить кинетику ХЛ исследуемых объектов с  кинетикой стандартных антиоксидантов трех типов (сильного, среднего и слабого), чтобы понять, антиоксиданты какого типа вносят основной вклад в ОАЕ исследуемых объектов. Во-вторых, рассчитать ОАЕ исследуемых объектов, измерив уменьшение светосуммы ХЛ под действием этих объектов в сравнении с действием антиоксиданта, обеспечивающего наибольший вклад в ОАЕ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектами исследования были промышленные образцы плодов боярышника, рябины и шиповника производства АО «Красногорсклексредства» (Россия), а также плоды малины, собранные авторами на территории Московской области в условиях естественного произрастания и высушенные при температуре 60–80 °С до прекращения выделения ими сока и деформации при надавливании.

Реактивами для анализа антиоксидантной емкости хемилюминесцентным методом служили: КH₂PO₄, 20 мМ буферный раствор (рН 7,4); пероксидаза из корней хрена (активность 112 ед./мг, М = 44 173,9), 1 мМ водный раствор; люминол (5-амино-1,2,3,4-тетрагидро-1,4-фталазиндион, гидразид 3-аминофталевой кислоты, М = 177,11), 1 мМ водный раствор; пероксид водорода (Н₂О₂, М = 34,01), 1 мМ водный раствор; растворы антиоксидантов (аскорбиновой кислоты, кверцетина, токоферола). Все реагенты — производства фирмы Sigma Aldrich (США).

Отвары плодов боярышника, рябины и шиповника и настой плодов малины готовили по методике Государственной фармакопеи СССР, изложенной в общей фармакопейной статье «Настои и отвары» [24].

Определение общей антиоксидантной емкости проводили путем регистрации хемилюминесценции на хемилюминометре Lum-100 («ДИСофт», Россия) с использованием программного обеспечения PowerGraph 3.3. Для определения ОАЕ в растительном сырье в кювету прибора помещали 40 мкл люминола в концентрации 1 мМ, 40 мкл пероксидазы хрена в концентрации 0,1 мкМ, от 10 до 50 мкл отвара или настоя (в зависимости от концентрации) и фосфатный буфер в количестве, необходимом для доведения общего объема пробы до 1 мл. Кювету устанавливали в прибор и регистрировали ХЛ, наблюдая фоновый сигнал. По истечении 48 с регистрации фонового сигнала в кювету вносили 100 мкл Н₂О₂ в концентрации 1 мМ и продолжали регистрацию ХЛ в течение 10 мин. Готовили по четыре пробы с различной концентрацией каждого из растительных объектов. Регистрировали также ХЛ для растворов аскорбиновой кислоты, кверцетина и токоферола в пяти различных концентрациях для каждого из антиоксидантов. В дальнейшем ОАЕ образцов отваров и настоя пересчитывали на кверцетин.

Концентрации люминола, пероксидазы хрена и перекиси водорода были подобраны так, чтобы определять антиоксидантную емкость водных извлечений из лекарственного растительного сырья за приемлемое время (не более 10 мин). За это время кривые хемилюминесценции для антиоксидантов аскорбата и флавоноида кверцетина (основные антиоксиданты растительного сырья) выходили на плато, что указывало на полное разрушение антиоксидантов в системе. Разведения исследуемых образцов и концентрации растворов стандартных антиоксидантов (указаны в подписях к рисункам) подбирали таким образом, чтобы все кинетические кривые ХЛ были измерены при одной и той же чувствительности прибора.

Антиоксидантную емкость рассчитывали по изменению площади (∆S) под кинетической кривой хемилюминесценции (светосуммы) при добавлении вещества, содержащего антиоксидант. Для этого подсчитывали S₀ для системы без антиоксиданта и вычитали из нее площадь S_S, характеризующую систему, в которую был добавлен антиоксидант. Величина ∆S зависит от чувствительности хемилюминометра и условий измерения. Отношение ∆S/C · V (где C — концентрация исследуемого биологического материала в кювете, г/л, и V — объем кюветы, л) выражает антиоксидантную емкость 1 г изучаемого материала, т. е. растительного сырья.

Аналогичным образом рассчитывали антиоксидантную емкость ∆S_A раствора стандартного антиоксиданта, например кверцетина, помещенного в тот же объем реакционной смеси. Отношение ∆S_A/C_A · V (где C_A — весовая концентрация антиоксиданта в кювете, г/л) выражает антиоксидантную емкость 1 г антиоксиданта.

Для каждого из стандартных антиоксидантов регистрировали сигнал от растворов нескольких концентраций, чтобы убедиться в том, что расчеты ведутся в пределах линейной зависимости, а полученные результаты воспроизводимы. Действительно, была получена линейная зависимость (∆S_A = k_A · C_A) сигнала от концентрации, по которой рассчитали стехиометрический коэффициент k_A. По критерию Фишера полученные для стандартных антиоксидантов значения k_A статистически значимы с вероятностью 0,975. Далее регистрировали сигнал от четырех концентраций для каждого из четырех растительных образцов, и  для всех образцов получили линейную зависимость сигнала от концентрации (∆S = k · C), по которой рассчитали стехиометрический коэффициент k. С вероятностью 0,975 (критерий Фишера) полученные для растительных образцов значения k статистически значимы. Общую антиоксидантную емкость растительного материала в  пересчете на массу стандартного антиоксиданта (мг%) находили по формуле.

Значения были представлены как среднее арифметическое ± среднеквадратическое отклонение (M ± δ) при p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изучение кинетики хемилюминесценции в присутствии аскорбата натрия (рис. 1) показало, что для этого антиоксиданта характерен латентный период, когда ХЛ практически полностью подавлена. Его продолжительность пропорциональна количеству антиоксиданта в системе. При этом не изменяется ни наклон кривых ХЛ, ни интенсивность ХЛ на плато. Это объясняется тем, что аскорбиновая кислота — сильный антиоксидант, перехватывающий все радикалы, образующиеся в системе, в том числе радикалы люминола, и ХЛ не развивается до тех пор, пока не окислится весь аскорбат.

Действие токоферола (рис. 2) проявлялось снижением интенсивности ХЛ на плато, что характерно для слабых антиоксидантов, хотя токоферол считается одним из самых мощных антиоксидантов. Возможно, такое несоответствие связано с тем, что в нашем опыте свободные радикалы находились в водном растворе, тогда как обычно действие токоферола изучают в неполярных средах. В работе [11], где источником радикалов служил комплекс цитохрома c с кардиолипином и реакция с люминолом протекала в пределах этого комплекса, токоферол имел свойства антиоксиданта средней силы.

Изучив действие различных концентраций кверцетина на нашу систему (рис. 3) и сравнив кинетические кривые для него и аскорбата натрия и токоферола, можно отметить, что основное действие кверцетина проявляется в изменении угла наклона кривых, т. е. скорости развития ХЛ, что типично для антиоксидантов средней силы.

Кривые ХЛ для всех изучаемых отваров (рис. 4) напоминают кривые для кверцетина с незначительным снижением интенсивности ХЛ в конце, т. е. при выходе на плато. Как показано в работе [11], такое поведение характерно для антиоксидантов средней силы, к которым в нашем случае можно отнести полифенолы — флавоноиды и дубильные вещества. Для настоя из плодов малины (рис. 4Г) заметно снижение хемилюминесценции на уровне плато, что характерно для слабых антиоксидантов [11], каким в данном случае является токоферол. В пересчете на кверцетин и токоферол в настое плодов малины содержится 4,7 ± 0,9 мкмоль/г кверцетина и 11,9 ± 0,8 мкмоль/г токоферола.

При сравнении кривых хемилюминесценции, полученных для различных концентраций четырех исследуемых водных извлечений из растительного сырья, показано, что вклад средних и слабых антиоксидантов в общую антиоксидантную емкость образцов снижался в ряду: настой плодов малины (рис. 4Г), отвар плодов шиповника (рис. 4В), отвар плодов рябины (рис. 4А), отвар плодов боярышника (рис. 4Б). Значения ∆S в расчете на концентрацию С изучаемого вещества в кювете и значения общей антиоксидантной емкости в пересчете на кверцетин приведены в таблице.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Полученные в ходе экспериментов данные и рассчитанные на их основе величины ОАЕ изучаемых объектов были сопоставлены с содержанием в них основных антиоксидантов, определенных с помощью химических методов анализа [25, 26, 27, 28, 29]. Несмотря на то, что положительная корреляция между суммарным количеством антиоксидантов и ОАЕ в разных объектах несомненна, все же между этими показателями имеются заметные различия. Например, если взять сумму содержания флавоноидов, дубильных веществ и аскорбиновой кислоты, то она оказывается больше рассчитанной ОАЕ для всех изучаемых объектов, кроме отвара плодов боярышника (таблица).

Другими исследователями также показано, что результаты химического анализа и значение ОАЕ, определенное хемилюминесцентным методом, часто не совпадают. В работе [19] общая антиоксидантная емкость, определенная в системе пероксидаза–люминол–перекись водорода коррелировала с содержанием тритерпеновых соединений. Однако в работе тех же авторов [18], в которой объектом исследования было другое растение, не наблюдали корреляции ОАЕ с содержанием какой-либо группы веществ, в том числе флавоноидов.

Подобные расхождения связаны по меньшей мере с тремя факторами. Во-первых, имеет значение активность антиоксидантов, т. е. скорость их взаимодействия с радикалами, которая различна для разных антиоксидантов, входящих в состав растительного образца. По данным Измайлова [11], константы скорости соответствующих реакций для мексидола, токоферола и кверцетина соотносятся как 0,04 : 2 : 60. Во-вторых, каждая молекула антиоксиданта, вступая в химическую реакцию, может перехватить различное количество радикалов. По данным работы [8], кверцетин, мочевая и аскорбиновая кислоты перехватывали 3,6 ± 0,1, 1,4 ± 0,1 и 0,5 ± 0,2 радикалов на одну прореагировавшую молекулу антиоксиданта соответственно (использовалась система гемин–H₂O₂–люминол). В-третьих, на результаты исследования могло оказать влияние наличие пероксидазной активности у самих растительных образцов, как в работе [23], а также наличие в образцах кальция, который, как это показано в работе [30], способен в определенных условиях повышать активность пероксидазы хрена. Обычно это обусловливает более высокую интенсивность ХЛ на плато, чем на контрольных кривых, чего мы, однако, не наблюдали.

Первый фактор резко ограничивает применение такого параметра, как изменение светосуммы, так как время измерения хемилюминесценции должно быть больше времени расходования всех антиоксидантов в исследуемом образце. О наступлении этого момента можно судить, только измеряя кинетику хемилюминесценции. Кроме того, вклад слабых антиоксидантов в ОАЕ резко занижен, поскольку время их полного окисления во много раз превышает приемлемую продолжительность измерения (10–20 мин).

Еще большее значение имеет стехиометрический коэффициент антиоксиданта. Количество радикалов n, перехватываемое им, равно, где ρ — стехиометрический коэффициент, а ∆m — изменение концентрации антиоксиданта за время измерения, в нашем случае — исходная концентрация исследуемого вещества в опытной пробе.

Разница в светосумме свечения в отсутствие антиоксиданта и в его присутствии пропорциональна n. Суммарное число перехваченных радикалов равно, где ρ_i — стехиометрический коэффициент конкретного антиоксиданта, а m_i — его концентрация во время измерения. Суммарное число перехваченных радикалов заведомо не равно суммарному количеству антиоксидантов, поскольку коэффициенты ρ_i не только не равны единице, но и существенно отличаются для разных антиоксидантов.

Величина n пропорциональна разнице светосумм, измеренных за определенное время между образцом, содержащим антиоксидант, и  контрольным образцом, не содержащим антиоксидантов: S = k · n, где k — коэффициент, постоянный при одинаковых условиях измерения.

Рассмотренный в статье метод позволяет определить общую антиоксидантную емкость, тогда как химический анализ позволяет определить суммарное содержание антиоксидантов в продукте. Поэтому метод хемилюминесценции представляется информативнее химических анализов.

ВЫВОДЫ

Подобранные нами условия оценки общей антиоксидантной емкости растительного сырья методом регистрации кинетики хемилюминесценции в системе, состоящей из пероксидазы хрена, перекиси водорода и люминола (концентрации компонентов — 4 нМ, 100 мкМ и 40 мкМ соответственно; 20 мМ фосфатный буфер, pH 7,4), обеспечили окисление сильных антиоксидантов (аскорбиновая кислота) и антиоксидантов средней силы (кверцетин) за 10  мин. Такая продолжительность измерения удобна и обеспечивает требуемое качество измерений.

Анализ кинетики хемилюминесценции показал, что в изученных объектах (отварах плодов рябины, шиповника, боярышника и настое плодов малины) основными антиоксидантами являются антиоксиданты средней силы, в том числе флавоноиды, и слабой силы (токоферол и др.). На основе уменьшения светосуммы хемилюминесценции была рассчитана общая антиоксидантная емкость для изученных объектов. Сравнение полученных значений ОАЕ с результатами химического анализа показало, что продукты, содержащие одно и то же количество антиоксидантов с разным их соотношением, могут различаться по своей способности эффективно защищать организм от вредного воздействия свободных радикалов. Описанная методика перспективна для изучения растительных объектов, в которых содержится смесь различных антиоксидантов. При этом она отличается простотой и невысокой стоимостью исследования. Сочетание измерения кинетики хемилюминесценции с математическим моделированием реакций позволит не только автоматизировать процесс определения ОАЕ, но и определять вклад отдельных групп антиоксидантов в показатель.