В работе Kang и соавт. [7] описан метод получения наночастиц оксида гадолиния Gd@SiO₂-DO3A и Gd@SiO₂-DO2A-BTA размером 50–60 нм. Наночастицы изготавливали из тетраэтилортосиликата (TEOS) и (3-аминопропил)триэтоксисилана (APTES) с последующей функционализацией аминопропилсилановых групп 1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетрауксусной кислотой (DOTA) или 1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7-трсуксусной кислотой, конъюгированной с бензотиазолом (DO3A-BTA). Полученные наночастицы отличались высокой растворимостью и стабильностью коллоидного раствора. Их релаксивность r1 оказалась намного выше, чем у низкомолекулярных контрастных веществ, а соотношение r2/r1 [8] приближалось к 1, что позволяет использовать их в МРТ [9]. Исследование биораспределения наночастиц показало, что Gd@SiO₂-DO2A-BTA выводятся из организма преимущественно с желчью и мочой. Они также накапливались в опухолевых клетках и оказались пригодны для уничтожения in vivo таких перевиваемых клеточных линий, как SK-HEP-1, MDA-MB-231, HeLa и Hep 3B. Хотя имеются сообщения о кумулятивной токсичности наноструктурированных контрастных веществ на основе гадолиния [10, 11], в частности, нефротоксичности [12], их применение в МРТ-диагностике различных заболеваний, а также перспектива использования в терапии опухолей представляют научный интерес, что подтверждается публикациями на эту тему [13].

Целью исследования являлась разработка технологии получения низкотоксичной композиции, содержащей Gd³⁺, для визуализации опухолевых тканей in vivo.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для обеспечения низкой токсичности композиции, предотвращения ее неспецифического связывания с нормальными тканями и обеспечения тропности к опухолевым клеткам были разработаны три решения.

Во-первых, в качестве комплексообразователя для ионов гадолиния использовали нетоксичное природное соединение — куркумин (рис. 1), содержащееся в большом количестве в корневищах индийского шафрана Curcuma longa и обладающее важными в контексте исследования характеристиками [14]: способностью вступать в устойчивые координационные связи с переходными металлами [15]; отсутствием токсичности в используемых концентрациях; гидрофобностью, что важно для включения комплексных соединений во внутреннюю область мицеллы и обеспечения устойчивости мицелл в водных растворах.

Во-вторых, получили мицеллярную форму композиции. В настоящее время технология изготовления мицеллярных форм препаратов используется в биотехнологии [16] и имеет перспективу применения в фармацевтике [17]. Мицеллярные формы обладают рядом преимуществ: в водных растворах они самоорганизуются в структуры с внутренней гидрофобной частью и наружной гидрофильной сферой, что позволяет включать внутрь плохо растворимые вещества и таким образом защищать последние от инактивации в биологических средах; имеют небольшой размер (менее 100 нм); циркулируют в крови долгое время; просты в изготовлении [18]. К преимуществам мицелл на основе блок-сополимеров (плюроников) можно отнести низкую цитотоксичность и слабую иммуногенность, а также простоту модификации поверхности функциональными группами для придания различных свойств. В нашей работе в качестве мицеллообразующих веществ были использованы амфифильные трехблочные сополимеры полиэтиленгликоля и полипропиленгликоля Pluronic F-127 и Pluronic P-123 (Sigma-Aldrich, США) (рис. 2).

В-третьих, отработали технологию придания функциональности (таргетности) мицеллам путем иммобилизации на их поверхности рекомбинантного векторного белка — фрагмента α-фетопротеина человека, обладающего сродством к опухолям многих типов [19].

В работе использовали следующие реагенты (все — производства Sigma-Aldrich, США): гадолиния нитрат (III) шестиводный, трехблочные сополимеры Pluronic F-127 и Pluronic P-123, триэтиламин, куркумин, 1,1′-карбонилдимидазол, N-гидроксисукцинимид, 2,4,6-тринитробензолульфоновую кислоту, тетрагидрофуран, диметилсульфоксид, метанол, диметилформамид, этаноламин, кобальта тиоцианат, бария гидроксид. Процедура получения векторного белка на основе α-фетопротеина человека описана в работе [19].

Получение комплексов куркумина с ионами гадолиния

Комплексы формировали в органическом растворителе тетрагидрофуране при смешивании нитрата гадолиния, куркумина и триэтиламина в молярном соотношении ~ 3 : 1 : 1 с нагреванием при 50 °С в течение 30 мин с последующим удалением триэтиламина и растворителя в роторном испарителе. Более подробный протокол: 100 мкл 0,5 M раствора куркумина в тетрагидрофуране смешивали с 300 мкл 0,5 М раствора нитрата гадолиния в тетрагидрофуране; затем при интенсивном перемешивании добавляли по каплям 100 мкл 0,5 М раствора триэтиламина в метаноле в течение 1–2 мин; смесь прогревали при перемешивании при 50 °С в течение 30 мин; растворители и триэтиламин удаляли из раствора с помощью роторного испарителя при 50 °С; осадок промывали метанолом и высушивали на воздухе.

Качественный анализ образования комплекса Gd³⁺ проводили на спектрофотометре Cary 50 Scan UV-Vis (Agilent Technologies, США) в диапазоне 300–650 нм в одноразовой кювете с длиной пути 1 см (Sigma-Aldrich, кат. № Z330418). Аликвоту комплекса массой от одного до нескольких мг отбирали шпателем в сухом виде, получали маточный раствор в диметилсульфоксиде (ДМСО), который затем разбавляли ДМСО до получения оптической плотности при 450 нм от 0,5 до 1,5. Концентрацию комплекса оценивали по высоте пика при 455 нм, который отсутствует у свободного куркумина. Для определения величины этого пика [20] из полученного спектра реакционной смеси вычитали спектр раствора свободного куркумина в ДМСО, взятого в той же концентрации, что указана выше.

Получение модифицированного сополимера Pluronic F-127 с концевыми NHS-группами для иммобилизации векторного белка на поверхности мицелл

Модификацию одного из сополимеров (Pluronic F-127) проводили в диметилформамиде (ДМФА) в два этапа. Сначала активировали концевые гидроксильные группы карбонилдиимидазолом (CDIz), затем проводили реакцию с N-гидроксисукцинимидом (NHS) (рис. 3). Более подробный протокол: 204 мг Pluronic F 127, 19 мг NHS и 26 мг CDIz смешивали в сухом виде и доводили объем реакционной смеси до 500 мкл с помощью ДМФА, перемешивали в течение 1 ч при 37 °С до прекращения выделения пузырьков газообразного CO₂ ; избыток CDIz удаляли, добавляя в реакционную смесь 50 мкл воды; после гидролиза избытка CDIz модифицированный сополимер экстрагировали несколько раз диэтиловым эфиром; осадок высушивали на воздухе.

Количество концевых NHS групп в модифицированном Pluronic F-127 определяли реакцией с избытком этаноламина в 10 мМ боратном буфере (pH 8,5) с последующим титрованием не прореагировавших аминогрупп 2,4,6-тринитробензолульфоновой кислотой (TNBS), как описано в работе [21].

Получение мицеллярных композиций

Мицеллярные системы различного состава на основе модифицированного сополимера получали по следующей схеме (рис. 4). Навески комплекса куркумин-гадолиний и плюроников растворяли в тетрагидрофуране и смешивали. Количество и соотношение компонентов в разных композициях варьировали (таблица). Затем раствор помещали в колбу роторного испарителя и удаляли органический растворитель при 50 °С при вращении роторной колбы. Добавляли в колбу дистиллированную воду и интенсивно перемешивали в течение 15 мин, после чего центрифугировали, отбирали супернатант и диализовали против фосфатно-солевого буфера (рН 7,5) при +4 °С в течение 24 ч.

Эффективность включения основного вещества в мицеллы (%) рассчитывали по форм. 1 , где М_вкл — масса включенного комплекса куркумин-гадолиний, М_исх — исходная масса комплекса куркумин-гадолиний. Степень нагрузки (масс.%) рассчитывали по форм. 2 , где М_пол — масса сополимера.

Химическая модификация поверхности мицелл

Конъюгацию мицелл с белком осуществляли, смешивая мицеллярный раствор на основе модифицированного полимера с раствором белка при молярном избытке сополимера (NHS групп) по отношению к белку. В качестве функционализирующего вещества использовали рекомбинантный модифицированный белок, соответствующий изолированному третьему домену α-фетопротеина человека [19]. Подробный протокол: 1 мл мицеллярного раствора смешивали с 200 мкл раствора белка с концентрацией 3 мг/мл (0,1 мМ) в фосфатно-солевом буфере (рН 8,0) с последующей инкубацией в течение 1 ч при комнатной температуре; для блокирования избыточных реакционноспособных NHS групп по окончании конъюгации добавляли избыток этаноламина до конечной концентрации в растворе 10 мМ с дополнительной инкубацией в течение 2 ч при комнатной температуре и последующим диализом против фосфатно-солевого буфера (рН 7,2) при +4 °С в течение суток. Полученную композицию хранили в течение недели при +4 °С.

Качественно присутствие белка в полученной мицеллярной композиции оценивали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с последующей окраской в течение 10 мин в 5 % водном растворе йодида бария [22].

Определение размера мицелл

Средний размер мицелл и их распределение по размеру измеряли методом динамического светорассеяния на приборе ZetasizerNano ZS (Malvern Ltd., Великобританию) в термостатируемых пластиковых микрокюветах ZEN0040. Измерение проводили с помощью гелий-неонового лазера с длиной волны 633 нм мощностью 4 мВт при 25 °С. Образцы перед измерением разводили деионизованной водой в 10 раз. Измерения для каждого образца проводили трижды, вычисляя среднеквадратичное отклонение.

Определение содержания гадолиния в мицеллах

Измерения проводили на рентгенофлюоресцентном анализаторе «Х-арт М» («Комита», Россия). Количественное определение производили относительным методом путем сравнения сигнала от исследуемых проб с сигналами от растворов сравнения с известными концентрациями гадолиния.

Определение содержания куркумина в мицеллах

Содержание куркумина оценивали по поглощению при длине волны 430 нм по сравнению с калибровочными растворами известной концентрации на спектрофотометре Cary 50 Scan UV-Vis в одноразовой кювете (Sigma-Aldrich, кат. № Z330418).

Содержание сухого вещества в полимерной форме

Определяли с помощью метода, описанного в работе [23] с модификациями. Приготовление реагента: смешивали 0,2 мл 2,6 М водного раствора тиоцианата кобальта (CoSCN) и 0,8 мл 0,8 М водного раствора гидроксида бария. Измерение: смешивали 10 мкл аликвоты раствора, содержащего плюроник, и 10 мкл реагента, интенсивно перемешивали, центрифугировали, тщательно удаляли супернатант, подсушивали на воздухе, добавляли к осадку 100 мкл ДМСО и 5 мкл 5 М HCl. Измеряли поглощение при 630 нм на приборе Titertek Multiskan Plus (LabX, Канада) в 96-луночных планшетах. Параллельно проводили измерения калибровочных растворов с известной концентрацией вещества и вычисляли концентрацию в анализируемом образце с помощью калибровочной кривой.

Определение общего белка

Содержание белка оценивали с помощью модифицированного метода Лоури с применением бицинхониновой кислоты (Sigma-Aldrich). В качестве калибровочного раствора взяли стандартный раствор бычьего сывороточного альбумина [24].

Оценка токсичности мицеллярной композиции комплекса куркумин-гадолиний

Для подтверждения возможности дальнейших исследований in vivo был проведен эксперимент по исследованию переносимости мицеллярной композиции животными. Использовали 10 самок мышей линии C57/black средней массой 25 г. Характеристики композиции при введении животным: Gd³⁺ 10 мМ, куркумин 10 мМ, Pluronic F-127 5 мМ, диаметр мицелл — 20 нм, буфер фосфатно-солевой (рН 7,0). Композицию вводили однократно в хвостовую вену в объеме 200 мкл. При выборе дозы стремились привести концентрацию плюроника в составе мицелл к той, которая оказалась оптимальной для доставки цитостатика «Доцетаксел» (Docetaxel) в клетки опухоли легких in vivo на мышиной модели [25]. Мышей наблюдали ежедневно в течение 2 мес., после чего их вывели из эксперимента и исследовали ткани гистологическими и патологоанатомическими методами.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Реакцию комплексообразования контролировали по изменению спектра, в частности, появлению дополнительного пика при 455 нм [20] (рис. 5).

Соотношение сополимер : NHS в модифицированном плюронике F-127 составило около 1 : 1. Всего получили около 100 мг в сухом виде модифицированного сополимера, содержащего одну NHS группу на молекулу.

Использованный метод получения мицеллярных композиций характеризовался эффективностью включения основного вещества в мицеллы в диапазоне 40–87 % и степенью нагрузки, равной 10–25 масс.%. В результате были получены мицеллярные растворы с различным содержанием основных компонентов (таблица).

Соотношение куркумина и ионов гадолиния в полученных композициях предполагает наличие вакантных валентностей у атома гадолиния, которые предположительно заняты молекулами воды, что важно для сохранения контрастных свойств при МРТ [26]. При оценке стабильности композиций необходимо отметить, что измерения их размеров методом динамического светорассеяния, а также спектра поглощения в видимой области, характерного для комплекса куркумина с ионами Gd³⁺, было воспроизведено через 10 дней хранения при температуре +4 °С. При этом все показатели оказались неизменными: отличия не превышали стандартной ошибки измерения первоначального эксперимента.

Размер полученных мицелл приближался к 100 нм, не превышая этой величины, что позволяет циркулировать в кровотоке долгое время, избегая захвата портальной системой печени и ретикуло-эндотелиальной системой [27]. Это свойство важно для обеспечения адресности доставки мицелл в опухолевые ткани за счет иммобилизованного на поверхности функционального белкового адреса [28].

В ходе эксперимента на животных видимых проявлений токсичности мицеллярной композиции не наблюдали. В частности, не были выявлены симптомы отравления тяжелыми металлами [1] — коллаптоидные реакции, кровотечения, сохранялся аппетит, активное движение, отсутствовали патологическая жажда и светобоязнь в течение всего времени наблюдения.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В работах [14, 29] доказана возможность использования куркумина в качестве комплексона, подавляющего токсичность ионов гадолиния in vivo. Patil и соавт. [29] использовали данные комплексы для контрастирования амилоидных бляшек при диагностике болезни Альцгеймера. При этом исследователи использовали естественное сродство куркумина к β-амилоиду. В нашей работе впервые показана возможность инкапсуляции гидрофобных комплексов куркумина во внутреннем пространстве мицелл, образованных плюрониками (блок-сополимерами полиэтиленгликоля и полипропиленгликоля). Благодаря выявленной устойчивости таких мицелл в водных средах собственные фармакокинетические характеристики куркумина перестают играть ключевую роль в распределении ионов Gd³⁺ в организме, тогда как высокая стабильность хелатированного комплекса сохраняется.

В работе [7] была поставлена задача, практически идентичная нашей, однако она была решена альтернативным способом: за счет включения ионов Gd³⁺ в наночастицы кремния. Это показывает практическую значимость самой задачи. При этом предлагаемое нами решение имеет важное технологическое преимущество перед описанным в работе [7]: оно может быть реализовано в биохимической лаборатории с применением коммерческих реагентов и общедоступного лабораторного оборудования с выходом, близким к 100 %, без привлечения профессиональных химиков-синтетиков. Предложенная технология имеет преимущество при масштабировании: она позволяет получать наноразмерные частицы, содержащие ионы Gd³⁺, как в минимально необходимых для эксперимента объемах, так и в промышленных объемах. При этом, несмотря на простоту технологии, абсолютные размеры частиц, разброс размеров и содержание в них основного вещества практически не отличаются от показателей, рекомендованных в работе [8]. Этот результат достигнут, в первую очередь, благодаря оптимальным свойствам природного комплексона куркумина в качестве хелатора ионов Gd³⁺.

Важным преимуществом мицелл перед твердыми наночастицами оксида кремния является также способность долгое время циркулировать в кровотоке, не подвергаясь элиминации производными моноцитов печени [9]. В то же время, по данным литературы мицеллы хорошо задерживаются сосудистой сетью опухолей, которая характеризуется большим числом разрывов и дефектов поверхности [30].

Дополнительное усиление адресности доставки мицелл, содержащих ионы Gd³⁺, может быть достигнуто за счет использования различных адресных функциональных групп. Домен 3 α-фетопротеина, использованный в настоящей работе, имеет высокое сродство к рецепторам опухолей многих типов, так как, подобно альбумину, используется ими в качестве питательного субстрата [19]. Предложенная технология позволяет эффективно иммобилизовать на поверхности мицелл любые белковые, пептидные и другие адресные группировки.

ВЫВОДЫ

Показано, что комплексы куркумина с ионами гадолиния эффективно включаются и прочно удерживаются мицеллами, образованными блок-сополимерами полиэтиленгликоля и полипропиленгликоля (плюрониками): в течение 10 суток хранения при +4 °С характеристики мицелл изменяются в пределах стандартной ошибки измерения выбранных аналитических методов. Мицеллы имеют стандартный размер 50–100 нм (в зависимости от соотношения компонентов), что обеспечивает их устойчивость в кровотоке долгое время.

Предложен метод модификации поверхности мицелл плюроников, содержащих комплексы куркумина и Gd³⁺, адресными молекулами, в частности, доменом 3 α-фетопротеина человека.