Тимус как центральный орган иммунной системы определяет выраженность защитных реакций организма и обеспечивает иммунный гомеостаз. Морфологические перестройки в тимусе, возникающие в ответ на действие различных факторов, в том числе введение препаратов с иммунотропными свойствами, сопровождаются изменением цитоархитектоники и микроокружения клеток [1, 2, 3, 4, 5, 6, 7].

В клинической практике широко применяется иммуномодулятор «Имунофан», воздействующий на иммунную и эндокринную системы и усиливающий клеточный и гуморальный иммунитет [8]. Это синтетический иммунорегуляторный гексапептид (аргинил-α-аспартил-лизил-валил-тирозил-аргинин), созданный на основе одного из фрагментов тимопоэтина, включающего аминокислотные остатки его активного центра. Фармакологическое действие «Иммунофана» заключается в коррекции состояния иммунной системы и установлении баланса окислительно-антиокислительных реакций в организме. Действие препарата начинается через 2–3 ч после введения и продолжается до 4 мес. В быстрой фазе действия (первые 2–3 суток) наблюдается прежде всего детоксикационный эффект: «Имунофан» нормализует перекисное окисление липидов, ингибирует распад фосфолипидов клеточной мембраны и синтез арахидоновой кислоты. В средней фазе (длится 7–10 суток) усиливаются реакции фагоцитоза и гибели внутриклеточных бактерий и вирусов, а в медленной (длится до 4 мес.) — восстанавливаются нарушенные показатели клеточного и гуморального иммунитета.

Имеется большое число исследований, посвященных изучению влияния «Имунофана» на различные системы организма животных и человека [1, 3, 9, 10, 11, 12], однако особенностям цитоархитектоники различных зон тимуса при иммуностимуляции препаратом, в том числе в разном возрасте, уделено недостаточно внимания. Целью исследования являлось изучение клеточного состава структурно-функциональных зон паренхимы тимуса крыс периода выраженных старческих изменений при иммуностимуляции «Имунофаном».

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследование провели на 60 белых беспородных крысах-самцах в возрасте 20 мес. и массой 300–330 г. Животных содержали в виварии (температура — 20–25 °C, влажность — не более 50 %, искусственное освещение — 12 ч, с 8:00 до 20:00) в стандартных пластиковых клетках по шесть особей в каждой со свободным доступом к воде и пище [13]. Ежедневное наблюдение за поведением и общим состоянием крыс показало, что все они были здоровы и активны.

Животных разделили на две группы по 30 особей. Крысам опытной группы вводили внутримышечно «Имунофан» («Бионокс», Россия, регистрационное свидетельство UA/0318/01/01) из расчета 0,7 мг/кг раз в сутки по схеме: 1, 3, 5, 7 и 9-е сутки (способ введения и дозу выбрали на основе рекомендаций для человека). Крысам контрольной группы вводили внутримышечно 0,9 % раствор хлорида натрия в эквивалентном объеме и в те же сроки. В обеих группах животных выводили из эксперимента по шесть особей через 1, 7, 15, 30 и 60 суток с момента последнего введения препарата (раствора NaCl) путем декапитации под эфирным наркозом.

Объектом исследования служил тимус. Забор, фиксацию материала и изготовление парафиновых блоков выполняли согласно общепринятым методикам работы с лимфоидными органами [14]. Для изучения структурных компонентов тимуса парафиновые срезы толщиной 4–6 мкм окрашивали гематоксилином и эозином, а для идентификации клеток — азуром II и эозином. Гистологическое строение исследовали с помощью аппаратно-программного комплекса, включавшего микроскоп Olympus CX-41, цифровой фотоаппарат Olympus SP 500UZ (Olympus, Япония) и программный пакет Morpholog (Украина) [15]. Микрофотографии получали в нескольких режимах увеличения, используя объективы PlanC N х10/0,25 ∞/–/FN22, PlanC N х40/0,65 ∞/0,17/FN22, PlanC N х60/0,80 ∞/0,17/FN22 с приближением zoom 132 и zoom 142. Изучали по шесть гистологических срезов тимуса каждого животного в шести полях зрения, что считается достаточным для получения репрезентативных результатов [16].

Определяли относительное содержание различных клеточных элементов (лимфобластов, малых, средних и больших лимфоцитов, макрофагов, митотически делящихся и деструктивно измененных клеток) на 100 клеток в структурно-функциональных зонах паренхимы тимуса: субкапсулярной зоне, внутренней зоне коркового вещества и мозговом веществе. Малые, средние и большие лимфоциты дифференцировали, основываясь на морфометрических показателях площади ядра клеток. Согласно Кривенцову [17], лимфоциты, имеющие площадь ядра от 6 до 14 мкм², расцениваются как малые, от 14 до 22 мкм² — как средние и от 22 до 30 мкм² — как большие.

Статистическую обработку данных проводили методом вариационной статистики с применением t-критерия Стьюдента (p <0,05). Распределение данных было нормальным. Тип распределения определяли с помощью критерия Колмогорова–Смирнова. Рассчитывали среднее арифметическое и ошибку среднего арифметического (M ± m).

Эксперимент был выполнен с соблюдением Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (Страсбург, 1986), и одобрен Комиссией по вопросам биоэтики Луганского государственного медицинского университета (протокол № 1 от 19.01.2013).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Возрастная инволюция тимуса была подтверждена сравнительным гистологическим исследованием тимуса крыс контрольной группы и крыс в период полового созревания (данные были получены нами ранее [18]). Размеры тимических долек визуально меньше, чем у более молодых животных (рис. 1). Они разделены перегородками, образованными толстыми прослойками соединительной ткани. Отмечается сглаженность корково-мозговой границы, увеличение доли мозгового вещества, замещение паренхимы долек белой жировой тканью. Подобные признаки возрастных изменений в тимусе 12-месячных крыс были описаны Морозом [19], 6–10-месячных крыс — Москвичевым и соавт. [6].

Тимус крыс опытной группы на всех этапах наблюдения сохранял морфологические особенности органа, характерные для крыс контрольной группы: так же отмечалось разрастание соединительнотканного компонента капсулы и междольковых перегородок и замещение части паренхимы жировой тканью. Но при большем увеличении микроскопа были выявлены изменения клеточного состава структурно-функциональных зон паренхимы.

В петлях стромы субкапсулярной зоны коркового вещества паренхимы тимуса крыс опытной группы, образованной сетью эпителиоретикулярных клеток и макрофагами, были расположены в несколько слоев лимфоидные клетки округлой формы, представленные в основном малыми и средними лимфоцитами, а также большими лимфоцитами и лимфобластами. Изредка встречались митотически делящиеся клетки. Эпителиоретикулярные клетки имели большие размеры и более светлую цитоплазму по сравнению с лимфоцитами, а также неправильную уплощенную форму. Макрофаги были крупными, неправильной отростчатой формы с типичной «пенистой» цитоплазмой. Кроме того, обнаруживались клетки лимфоидного ряда с признаками деструкции (гиперконденсированный хроматин в сморщенном ядре). Было отмечено увеличение в сравнении с контролем числа клеток лимфоидного ряда и макрофагов при одновременном снижении числа клеток с признаками деструкции (рис. 2). Однако показатели были статистически значимыми только для животных, декапитированных на 7, 15 и 30-е сутки после последнего введения «Имунофана». Характерно, что содержание эпителиоретикулярных клеток не отличалось достоверно от контрольных значений ни в одной из опытных подгрупп.

Внутренняя зона коркового вещества отличалась максимальной плотностью расположения клеток. Она была представлена несколькими слоями средних и малых лимфоцитов, иногда — в процессе митотического деления, располагавшихся в сети, образованной эпителиоретикулярными клетками и макрофагами. Встречались также лимфоидные клетки с признаками деструкции ядра и цитоплазмы. Изменения клеточного состава внутренней зоны были аналогичны тем, что отмечались в субкапсулярной зоне. Через сутки после введения «Имунофана» на 8,5 % увеличилось содержание средних лимфоцитов и на 48,0 % уменьшилось содержание деструктивно измененных клеток (p <0,05) (рис. 3). При декапитации на 7-е сутки выявили большее количество средних и малых лимфоцитов, митотически делящихся клеток, макрофагов, а меньшее — клеток эпителиоретикулярной стромы (на 15,8 %) и клеток с признаками деструкции (на 62,2 %). На 15-е сутки наблюдали те же закономерности, что и неделей ранее, однако увеличение содержания средних лимфоцитов не было статистически значимым. На 30-е сутки отклонение от значений показателей в группе контрольных животных в положительную сторону было характерно только для малых лимфоцитов (11,3 %) и макрофагов (51,3 %), в отрицательную — для эпителиоретикулярных и деструктивно измененных клеток (14,9 и 23,1 % соответственно). При декапитации на 60-е сутки статистически значимых отличий не обнаружили.

Мозговое вещество отличалось от коркового сниженной плотностью расположения лимфоидных клеток, представленных преимущественно малыми и средними лимфоцитами. Здесь содержалась более густая, чем в корковом веществе, сеть крупных эпителиоретикулярных клеток, расположенных в виде тяжей или скоплений. Лимфобласты и большие лимфоциты не были обнаружены в мозговом веществе; содержание средних лимфоцитов было достоверно выше на 7, 15 и 30-е сутки наблюдения (на 6,1, 9,3 и 7,5 % соответственно), а содержание малых лимфоцитов — на 7 (8,6 %), 15 (10,0 %), 30 (11,0 %) и 60-е сутки (10,4 %) (рис. 4). Содержание митотически делящихся клеток незначительно превышало контрольный уровень лишь на 7-е сутки. Количество же деструктивно измененных клеток значительно уменьшилось на 15 и 30-е сутки. Отличия в содержании эпителиоретикулярных клеток и макрофагов были недостоверны.

К моменту окончания эксперимента (60-е сутки) численность малых и средних лимфоцитов, молодых форм клеток, митотически делящихся клеток и макрофагов уменьшалась и в целом достигала значения, выявленного для контрольных животных.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Полученные результаты свидетельствуют о заметной реактивности тимуса крыс периода выраженных старческих изменений на введение иммуномодулятора «Имунофан». Схожие изменения клеточного состава в субкапсулярной и внутренней зонах коркового вещества тимуса свидетельствуют о вовлечении в перестройку цитоархитектоники всего коркового вещества. Мозговое вещество является наиболее ареактогенной зоной паренхимы тимуса [17], однако его клеточный состав у крыс опытной группы претерпевал изменения. Возможным механизмом иммуностимулирующего эффекта препарата (временного частичного замедление возрастной инволюции тимуса) может являться поддержание и/или восстановление популяции как лимфоидных клеток, так и клеток микроокружения, в частности макрофагов. Число эпителиоретикулярных клеток в субкапсулярной зоне и мозговом веществе статистически достоверно не изменялось, и это дает возможность предположить, что имунофан не угнетает резервные возможности тимуса.

Изменения цитоархитектоники паренхимы тимуса, заключающиеся в повышении плотности клеточной популяции во всех изученных структурно-функциональных зонах, увеличении содержания клеток лимфоидного ряда, в том числе молодых форм, могут свидетельствовать о более активном поступлении в тимус клеток-предшественниц из красного костного мозга и об усилении внутритимической пролиферации лимфоцитов. Такое кратковременное стимулирующее влияние на тимус некоторые авторы наблюдали для другого иммуномодулятора — «Полиоксидония» [4, 6]. Захаров [3] указывает на замедление естественных инволютивных процессов в тимусе половозрелых лабораторных крыс после введения «Имунофана».

ВЫВОДЫ

Для тимуса крыс периода выраженных старческих изменений была характерна заметная реактивность на введение «Имунофана». Курс инъекций терапевтических доз препарата животным способствовал восстановлению структуры тимуса, тем самым замедляя возрастную инволюцию органа. Наличие тесной взаимосвязи между различными клеточными компонентами тимуса определяет необходимость изучения баланса между лимфоцитами тимуса и структурами микроокружения в условиях воздействия на организм лабораторных животных иммунотропных препаратов.