Ишемия нижних конечностей — хроническое окклюзирующее поражение ног, причинами которого являются атеросклероз, облитерирующий эндартериит и диабет [1, 2]. Разработаны хирургические методы лечения заболевания: операции через разрез кожи (шунтирование, эндартерэктомия) и различные малоинвазивные техники (рентгенохирургическая ангиопластика, стентирование), — которые позволяют восстановить проходимость артерии, если она закупорена полностью, или улучшить кровоток при ее неполной закупорке. Однако оперативное лечение показано лишь половине пациентов [3, 4, 5, 6].

Решением проблемы служит медикаментозная терапия. Наибольшую эффективность при лечении критической ишемии ног показал препарат «Вазапростан» (UCB Pharma, Германия), действующим веществом которого является алпростадил — синтетический аналог естественного простагландина Е1. Но действие препарата направлено не на расширение сосудов и, как следствие, увеличение кровотока в периферических сосудах, а на изменение биохимического состава крови при длительной циркуляции «Вазапростана» в крови [7].

Существует также ряд препаратов, воздействующих на липидный обмен, состояние периферического сосудистого русла, реологические свойства крови, но они не устраняют ключевой фактор развития критической ишемии ног — ангиоспазм. Надежды возлагаются на класс препаратов, которые облегчают дилатацию сосудов за счет действия эндогенного оксида азота (NO), выделяемого нервными окончаниями и эндотелиальными клетками и усиливающего синтез внутриклеточного алармона — циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ). Такой же эффект дает применение силденафила — специфического ингибитора фосфодиэстеразы 5-го класса (ФДЭ-5), фермента, гидролизующего цГМФ [1, 2, 8, 9, 10].

Все больший интерес вызывает «Церебролизин» (EVER Neuro Pharma, Австрия) — препарат для лечения инсульта, болезни Альцгеймера и травматических повреждений головного мозга. Было показано, что он уменьшает ферментативную активность супероксиддисмутазы и каталазы — двух основных ферментов, активирующихся при окислительном (оксидативном) стрессе. Однако делает он это не прямо, а за счет снижения уровня образования супероксид-аниона и перекиси водорода, являющихся субстратами указанных ферментов. Кроме того, была продемонстрирована способность «Церебролизина» снижать уровень образования гидроксильных радикалов [11, 12, 13]. Также в исследованиях, выполненных in vitro и in vivo, было показано, что препарат уменьшает активность кальпаина примерно на 60 %, и значительно меньшее число клеток гибнет от апоптоза [14].

Целью нашей работы была оценка эффективности фармакотерапии силденафилом (Viagra, Pfizer, Франция) и «Церебролизином» ишемии нижних конечностей, смоделированной у крыс.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эксперименты проводили на крысах линии Wistar в возрасте 4 мес. и массой 230–260 г, прошедших карантинирование в условиях вивария НИИ экологической медицины Курского государственного медицинского университета. Для исследования были взяты здоровые животные. Их содержали в стандартной экспериментальной биологически чистой комнате с температурой воздуха 22–24 °С и при цикличном освещении (по 12 ч света и темноты). Все крысы получали гранулированный корм и фильтрованную водопроводную воду. Манипуляции проводили в одно и то же время во второй половине дня. Наркотизацию животных осуществляли внутрибрюшинным введением водного раствора хлоралгидрата в дозе 300 мг/кг веса, выведение из эксперимента — его передозировкой. В исследовании соблюдали принципы, изложенные в «Конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей» (Страсбург, 1986).

Животных распределили по группам путем стратифицированной рандомизации со стратификацией по массе тела, а также по проводимым операциям и манипуляциям. Были сформированы следующие группы:

1. интактные животные (n = 20);
2. ложнооперированные животные (n = 20);
3. животные с ишемией мышц голени, не получавшие лечения (контрольная группа, n = 20);
4. животные с ишемией мышц голени, получавшие силденафил (n = 20);
5. животные с ишемией мышц голени, получавшие «Церебролизин» (n = 20);
6. животные с ишемией мышц голени, получавшие силденафил и «Церебролизин» (n = 20).

Группу ложнооперированных животных сформировали из крыс, которым под наркозом разрезали кожу вдоль бедра по внутренней поверхности, выделяли сосудисто-нервный пучок бедра и ушивали рану непрерывным швом.

Ишемию мышц голени моделировали под наркозом, фиксируя животное в положении «на спине». Шерсть на внутренней поверхности бедра тщательно выстригали, кожу обрабатывали 70 % раствором спирта. Разрез осуществляли вдоль бедра по внутренней поверхности. Выделяли элементы сосудисто-нервного пучка бедра. Артерию отделяли от вены и нерва, лигатуру накладывали у ее начала до отхождения arteria saphena (под паховой связкой), которая является аналогом глубокой бедренной артерии человека [15]. Перевязывали и пересекали a. saphena. Выделяли подколенную артерию и начальные отделы артерий голени (передняя и задняя большеберцовые артерии), которые пересекали, не перевязывая. Затем пересекали бедренную артерию на 3 мм ниже наложенной ранее лигатуры. Участок магистрального сосуда, включающий бедренную и подколенную артерии и начальные отделы передней и задней большеберцовых артерий, удаляли. Ретроградного кровотечения из артерий голени не наблюдалось. Рану ушивали непрерывным швом [16].

Животным 4 и 6-й групп перорально вводили силденафила цитрат в дозе 2,2 мг/кг в течение 28 и 7 дней соответственно. Животным 5 и 6-й групп инъецировали внутримышечно церебролизин в дозе 0,005 мл в течение 20 и 10 дней соответственно [17]. Уровень микроциркуляции крови в мышцах голени определяли на 21 и 28-е сутки при помощи оборудования производства компании Biopac Systems (США): полиграфа МР100 с модулем лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ) LDF100C и инвазивного игольчатого датчика TSD144. Регистрацию и обработку результатов ЛДФ производили с помощью программы AcqKnowledge 3.8.1 (Biopac Systems), значения микроциркуляции выражали в перфузионных единицах (ПЕ). Запись кривой уровня микроциркуляции осуществляли в пяти точках (середина длины мышцы, точки на 3–5 мм выше и ниже, латеральнее и медиальнее первой точки) в течение 30 с в каждой точке.

Животных выводили из эксперимента на 21 и 28-е сутки (по 10 крыс в каждый срок) путем передозировки наркоза. В каждом случае производили аутопсию с дальнейшей подготовкой препарата мышцы голени. Гистологический материал фиксировали в 10 % формалине в течение 7 сут. Парафиновые блоки и микропрепараты изготавливали по стандартной методике. Препараты окрашивали гематоксилином и эозином, а также по Ван Гизону, а затем изучали с помощью микроскопа Levenhuk 320 (Levenhuk, США). Для морфометрической оценки фотографировали препараты с использованием цифровой насадки Levenhuk C310 и программы ScopeTek ScopePhoto 3.1.268 (Hangzhou Scopetek Opto-Electronic Co., Китай). На микрофотографиях при увеличении 4 × 20 × 6 изучали количественные изменения кровеносных сосудов в поле зрения.

Учитывая литературные данные о возможности компенсаторного восстановления регионарного кровообращения в выбранной нами модели, наиболее информативными считали данные, полученные на 28-е сутки. Данные, полученные на 21-е сутки, рассматривали как промежуточные [18].

Статистический анализ полученных данных осуществляли в программе Microsoft Excel 10.0. Рассчитывали средние значения (M) показателей и ошибки среднего (m). Использовали двухвыборочный t-тест с различными дисперсиями для сравнения показателей в различных группах животных и определения достоверности различий между ними. Статистически значимыми считали различия при p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Среднее значение уровня микроциркуляции в мышцах голени интактных животных на 21-е сутки составило 527 ± 13 ПЕ. Гистологическое исследование показало, что миоциты образовывали плотные пучки, в толще которых проходили полнокровные венулы и артериолы, содержавшие единичные эритроциты. Просветы сосудов были широкими, эндотелиальные клетки — без патологических изменений (рисунокА).

В группе ложнооперированных животных средние значения уровня микроциркуляции не отличались достоверно от таковых в группе интактных животных: 519 ± 13 ПЕ — на 21-е сутки (р = 0,66) и 521 ± 16 ПЕ — на 28-е сутки (р = 0,77). Отличий в строении мышечной ткани также не выявили (рисунокБ).

В группе животных с ишемией мышц голени, не получавших лечения, средние значения уровня микроциркуляции были достоверно ниже в сравнении со значениями показателя в группе интактных крыс: 325 ± 3 ПЕ — на 21-е сутки (р < 0,05) и 371 ± 2 ПЕ — на 28-е сутки (р < 0,05). На 21-е сутки пораженные мышцы выглядели набухшими, имелись крупные участки серовато-коричневого цвета. Гистологическое исследование показало, что это крупные очаги организующегося некроза с резорбцией некротических волокон и разрастанием грануляционной ткани. На 28-е сутки цвет мышц нормализовался, но они выглядели несколько гипотрофичными. Участки резорбируемого некроза были значительно мельче. В микроциркуляторном русле отмечались полнокровие и новообразование единичных капилляров. Вблизи участков некроза встречались пучки атрофированных мышечных волокон (рисунокВ).

Коррекция силденафилом способствовала достоверному повышению уровня регионарного кровотока в ишемизированных мышцах голени крыс по сравнению с 3-й группой на соответствующем сроке: 425 ± 4 ПЕ — на 21-е сутки (р < 0,05) и 803 ± 10 ПЕ — на 28-е сутки (р < 0,05). Уровень микроциркуляции в 4-й группе на 21-е сутки приближался к значению этого показателя в группе интактных животных, а на 28-е сутки значительно превосходил его. Макроскопически ишемизированные мышцы не отличались по общему виду и цвету от мышц интактных крыс. При микроскопии некротических изменений также не обнаружили, однако в некоторых участках встречали мелкие очаги атрофирующихся миоцитов с пролиферацией клеток (рисунокГ).

В группе животных с ишемией мышц голени, получавших «Церебролизин», был отмечен достоверный рост уровня микроциркуляции в сравнении с 3-й группой: 429 ± 12 ПЕ — на 21-е сутки (р < 0,05) и 767 ± 8 ПЕ — на 28-е сутки (р < 0,05). На 21-е сутки в мышцах имелись отдельные участки серовато-коричневого цвета, представлявшие собой крупные очаги организующегося некроза с резорбцией некротических волокон и разрастанием грануляционной ткани. На 28-е сутки мышцы не отличались по общему виду и цвету от мышц интактных крыс. При микроскопии некротические изменения в мышцах не обнаруживались. В микроциркуляторном русле отмечались полнокровие и новообразование капилляров (рисунокД).

При комбинированной коррекции ишемии силденафилом и «Церебролизином» на 21-е сутки среднее значение уровня микроциркуляции составило 754 ± 9 ПЕ (р < 0,05 в сравнении с контрольной группой животных), а на 28-е сутки оно возросло до 1004 ± 13 ПЕ (р < 0,05). Морфологическая картина была идентична картине при коррекции силденафилом (рисунокЕ).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Наши результаты говорят о том, что фармакологическая коррекция ишемии мышц голени крыс как при терапии силденафилом и «Церебролизином, так и при монотерапии данными препаратами способствует достоверному повышению уровня регионарного кровотока. Однако совместное применение силденафила и «Церебролизина» эффективнее стимулирует развитие коллатералей сосудистого русла.

Силденафил — ингибитор ФДЭ-5, фермента, вовлеченного во многие биохимические процессы в клетке. Открытия последних десятилетий показали возможность применения ингибиторов ФДЭ-5 для лечения различных патологических состояний [19]. Силденафил запускает каскад, который активирует протеинкиназу С и повышает внутриклеточный уровень цГМФ в кардиомиоцитах за счет активации индуцибельной и эндотелиальной NO-синтаз. В результате достигается эффект кардиопротекции, опосредованный открытием митохондриальных АТФ-чувствительных калиевых каналов (mitoKATP-channels) [20]. Открытие mitoKATP-каналов увеличивает электрохимический потенциал на мембране клеток миокарда, скорость синтеза АТФ и транспорта Ca²⁺ через мембрану. Происходит расслабление гладкомышечных клеток, расширяется просвет артерий, увеличивается приток крови [21].

Именно mitoKATP-каналы играют главную роль в реализации антиишемической защиты. Они обнаружены в клетках многих органов, в том числе сосудистой сети. Первоначально их активность была выявлена в сарколемме (sarcKATP-channels), а затем — в митохондриях. Активность тех и других ингибируются физиологическими внутриклеточными концентрациями АТФ, т. е. каналы открываются при существенном снижении концентрации АТФ или общего пула адениновых нуклеотидов, являясь таким образом сенсорами (датчиками) наличия достаточного количества кислорода и глюкозы (источников АТФ). Можно предположить, что цитопротекторное свойство силденафила объясняется работой KATP-каналов [21].

Вероятно, силденафил также стимулирует в ишемизированной мышце голени крысы неоваскулогенез. Свидетельством этого являются полученные нами результаты ЛДФ и морфологического исследования: на 28-е сутки происходило компенсаторное восстановление и затем усиление регионарного кровотока в ишемизированных мышцах животных опытных групп за счет новообразования сосудов.

Ранее нами было упомянуто, что «Церебролизин» уменьшает ферментативную активность супероксиддисмутазы и каталазы (антиоксидантный эффект) и обладает антиапоптическим действием. Однако, кроме того, препарату свойствен противовоспалительный эффект [22, 23]. Таким образом, «Церебролизин» создает благоприятные условия для стимуляции естественных механизмов ангиогенеза силденафилом.

ВЫВОДЫ

Показана высокая эффективность терапии ишемии нижней конечности, смоделированной на крысах, комбинацией силденафила и «Церебролизина». Уровень микроциркуляции крови в пораженных мышцах голени животных соответствующей опытной группы на 28-е сутки был достоверно практически в два раза выше (в перфузионных единицах), чем у животных контрольной группы.