Несмотря на успехи в диагностике и лечении онкологических заболеваний, смертность от рака остается по-прежнему высокой. Важной проблемой, влияющей на эффективность лечения, является гетерогенность опухолевых популяций [1]. Опухоли одних и тех же типов у разных людей по-разному отвечают на одну и ту же терапию. Поэтому актуальной задачей является определение раннего ответа опухоли на лечение, чтобы своевременно скорректировать его. В литературе встречаются работы, направленные на поиск критериев оценки эффективности противоопухолевой терапии [2], но достаточно надежные критерии пока не предложены.

Оптическая когерентная томография (ОКТ) — прижизненный неинвазивный метод диагностики, предназначенный для «видения в мутных средах». ОКТ обеспечивает формирование двух- и трехмерных изображений внутренней структуры биологических тканей путем регистрации обратного рассеяния в режиме реального времени на глубине до 1-2 мм. Технология основана на низкокогерентной интерферометрии с широкополосным светом в ближнем инфракрасном диапазоне длин волн (в «терапевтическом окне прозрачности» 0,7-1,3 мкм) [3, 4, 5]. ОКТ не оказывает повреждающего воздействия на организм, т. к. мощность излучения составляет всего около 3-5 мВт, а, кроме того, отличается более высоким по сравнению с ядерной магнитной томографией и высокочастотным ультразвуковым исследованием пространственным разрешением (до 15 мкм), относительной простотой и дешевизной. В клинических исследованиях метод применяется для ранней диагностики неоплазии, определения границ опухолевого роста при планировании резекции и динамического наблюдения за пациентами с онкологической патологией для своевременного выявления рецидивов [6].

Возможности метода могут быть существенно расширены за пределы стандартной визуализации тканевой структуры, в том числе для получения информации о кровотоке и структуре сосудистой сети. Эта дополнительная функциональная возможность имеет важное приложение в биологии и медицине, поскольку позволяет получать in vivo и в динамике информацию о функционировании ткани, необходимую, например, для лечения онкологических заболеваний, т. к. ряд методов включает воздействие на сосудистую структуру опухолей [7]. Ввиду этого развитием ОКТ-методов прижизненной визуализации микрососудов занимаются во многих исследовательских лабораториях. Значительным потенциалом выявления, визуализации и количественной характеристики и мониторинга микроциркуляции в тканях обладают методы, основанные на временной изменчивости спеклов [8].

Механические свойства тканей связаны с их структурой и функцией, которые изменяются при развитии патологии и в ходе лечения. Внимание к решению проблемы определения жесткости тканей (эластографического картирования) методами ОКТ возрастает на протяжении последних 15 лет. ОКТ-эластография была продемонстрирована in vivo [9] и предложена для обнаружения опухолей в мягких тканях [10], был показан потенциал метода для обеспечения контраста между злокачественными и нормальными тканями молочной железы [11, 12, 13]. Недавние исследования показали, что хотя различия в жесткости ткани не проявляются на отдельных ОКТ-изображениях, они могут быть визуализированы на основе анализа серии ОКТ-изображений деформируемой ткани [14, 15]. Пока на рынке нет ни одного ОКТ-прибора с режимом эластографического обследования. В России развитием ОКТ-методов занимаются в нескольких научных организациях в Нижнем Новгороде, Саратове, Санкт-Петербурге, но с ОКТ-эластографией работает только группа исследователей из Института прикладной физики РАН (Нижний Новгород) и Нижегородской государственной медицинской академии (НижГМА) [16].

Сочетание описанных подходов, т. е. мультимодальная ОКТ, может быть эффективным средством мониторинга ответа опухоли на противоопухолевую терапию, может позволить получить новые знания и сделать шаг вперед в направлении индивидуализации лечения. Целью данной работы являлась апробация трех модальностей ОКТ для оценки ответа опухоли на лечение.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Животные и опухолевая модель

Исследование было выполнено на экспериментальной модели карциномы кишечника мыши СТ26. Опухоль прививали 8-недельным самкам мышей линии BALB/c массой 20-22 г внутрикожно в наружную часть ушной раковины. Прививку осуществляли суспензией опухолевых клеток: 200 тыс. клеток в 20 мкл фосфатного буфера. Опухолевая модель на ухе характеризуется поверхностным ростом, относительно небольшим размером узла (несколько миллиметров в диаметре), доступностью проведения как визуального осмотра, так и оптического биоимиджинга. Эксперимент был одобрен Этическим комитетом НижГМА (протокол № 14 от 10 декабря 2013 г.).

Фотодинамическая терапия

В качестве метода противоопухолевой терапии была выбрана фотодинамическая терапия (ФДТ), которая воздействует как на сосудистый компонент опухоли, так и на клетки, в течение непродолжительного периода — от нескольких часов до нескольких дней. ФДТ проводили через 10-14 дней с момента прививки опухоли, когда опухолевый узел достигал размера 3,5-4,0 мм, а сосудистая сеть была хорошо развита. Животным вводили внутривенно «Фотодитазин» («Вета-Гранд», Россия) в дозе 5 мг/кг. Через 1 ч после введения фотосенсибилизатора опухоль облучали диодным лазером с длиной волны 659 нм в дозе 75 Дж/см² (100 мВт/см²). В опытной группе было 10 животных, в контрольной — 5.

Мультимодальная оптическая когерентная томография

Мониторинг ответа опухоли на ФДТ проводили методом ММ ОКТ на приборе, разработанном в Институте прикладной физики РАН. Технические характеристики прибора: рабочая длина волны — 1,3 мкм, мощность на выходе —15 мВт, поперечное пространственное разрешение — 25 мкм, пространственное разрешение по глубине — 15 мкм, глубина сканирования — до 1,7 мм. Зондирующее излучение имеет круговую поляризацию, скорость сканирования — 20 000 А-сканов/с.

ММ ОКТ-исследование осуществляли бесконтактным способом путем поднесения к исследуемой поверхности оптического зонда на рабочее расстояние в 1,5 см.

В режиме кросс-поляризационной ОКТ (КП ОКТ) получали двумерные изображения (В-сканы) размером 4 x 4 мм, состоявшие из двух изображений в псевдоцветной палитре: верхнего — ко-поляризационного, где уровень сигнала показывал степень обратно рассеянных на объекте волн, сохранивших исходную поляризацию, и нижнего — кросс-поляризационного, где уровень сигнала показывал степень обратно рассеянных на объекте волн, изменивших исходную поляризацию на ортогональную. В большинстве случаев кросс-рассеяние наблюдается от высокоорганизованных анизотропных структур — коллагеновых и эластических волокон [17]. Режим КП ОКТ позволяет также производить запись ЗD-изображений в ко- и кросс-поляризации, каждое из которых объемом 4 х 4 х 2 мм (планарные размеры х глубина).

Количественная обработка КП ОКТ-изображений заключалась в вычислении по выделенной области интереса интегрального фактора деполяризации (ИФД). Область интереса выделяли вручную, основываясь на гистологических данных и качественных характеристиках КП ОКТ- изображения. Алгоритм вычисления ИФД был разработан нами ранее [18] и применен для оценки состояния коллагеновых волокон различных тканей (слизистой оболочки мочевого пузыря и полости рта; аорты и коронарных сосудов). В основе вычисления ИФД лежит усредненное по области интереса отношение яркостей ОКТ-сигнала в кросс- и ко-поляризации.

Информацию о жесткости ткани получали с помощью ОКТ-эластографии. Для обработки информации, содержавшейся в ОКТ-сигнале, использовали новый улучшенный (гибридный) вариант фазового подхода к отслеживанию изменений положений рассеивателей [16]. Для этого зонд немного прижимали к исследуемой поверхности (компрессионный способ получения информации) и определяли деформации, возникавшие вблизи зонда. В основе построения эластографических карт лежит анализ пространственной неоднородности изменения фазы ОКТ-сигнала сравниваемых изображений ткани в процессе ее деформирования. В итоге получают изображение в псевдо-цветной палитре, на котором более жесткие (слабо деформируемые) участки обозначены синим цветом, более мягкие (сильно деформируемые) — красным.

Исследование микроциркуляторного русла проводили методом ОКТ-микроангиографии (ОКТ МА). Физический принцип выделения сосудистой сетки основан на определении временной изменчивости амплитуды и фазы ОКТ-сигнала на серии пикселизованных ОКТ-изображений одной и той же области ткани: в тех местах, где сигнал быстро меняется от скана к скану, находится текущая жидкость (кровь); там, где амплитуды и фазы пикселей изображения стабильны, движения жидкости нет. Следовательно, методом ОКТ МА можно визуализировать как наличие кровотока, так и остановку крови, например, в случае тромбоза в результате действия ФДТ. ОКТ МА-изображения получали с области 2 x 2 мм³. Паттерн был высокочувствительным и позволял визуализировать мелкие сосуды. ОКТ МА-изображения после постобработки представляли собой проекцию максимальной интенсивности сигнала — вид сосудистой сетки сверху со всей глубины визуализации [19].

Флуоресцентная микроскопия

Данные о структуре сосудистой сетки, полученные методом ОКТ МА, верифицировали методом флуоресцентной микроскопии с помощью флуоресцентного стереомикроскопа Axio Zoom.V16 (Zeiss, Германия) с применением флуорофора НТО, конъюгированного с декстраном (Sigma-Aldrich, США). Флуорофор вводили внутривенно в хвостовую вену в дозе 50 мг/кг. Изображения получали в течение 10 мин после введения флуорофора.

Гистология

Верификацию гибели опухолевых клеток и расстройства кровообращения выполняли методом световой микроскопии через 2 дня после ФДТ. Материал фиксировали в 10 % нейтральном формалине. Приготовленные с помощью микротома Leica SM 2000 R (Leica Biosystems, Германия) гистологические срезы толщиной 7 мкм после депарафинизации окрашивали гематоксилином и эозином для определения общего морфологического состояния опухолевой ткани.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

ММ ОКТ-визуализация тканей уха мыши

КП ОКТ

Ткань уха представляет собой слоистую структуру, состоящую из эпидермиса, дермы с придатками кожи и хряща (рис. 1А). КП ОКТ-изображение нормальной ткани уха в ко-поляризации представляет собой слоистую структуру, где посередине ушной раковины расположен хрящ в виде узкой полосы с низким уровнем сигнала, по обе стороны от которого — слои дермы с высоким уровнем сигнала. Эпидермис визуализируется над слоем дермы в виде очень тонкой полосы с низким уровнем сигнала (рис. 1Б). В кросс-поляризации изображение также слоистое, но уровень сигнала каждого из описанных для ко-поляризации слоев на порядок ниже, поскольку на этом изображении виден сигнал только от оптически анизотропных структур, таких как коллагеновые и эластические волокна дермы и хрящ. С развитием опухолевого узла в толще дермы постепенно увеличивается общий объем ткани над хрящом, и на КП ОКТ-изображении слоистость ткани нарушается. Бесконтактный способ сканирования ткани позволяет видеть на изображении характерный бугорок (выпуклость) в месте развития опухоли (рис. 1Г). Плотно расположенные клетки опухоли практически не рассеивают зондирующее излучение в ко-поляризацию, кросс-рассеяние также не наблюдается. Вокруг опухолевого узла заметно снижение уровня сигнала за счет дезорганизации коллагеновых волокон дермы (рис. 1Г).

ОКТ МА

С помощью ОКТ МА визуализировали структуру сосудистой сети участка нормального уха (рис. 2Б) и участка уха с опухолью СТ26 (рис. 2Г). В нормальной ткани видны преимущественно крупные сосуды — артериолы и венулы. При развитии патологического процесса визуализируются мелкие сосуды, которые образуют густую переплетенную сеть. Это связано, по-видимому, как с образованием новых опухолевых сосудов, так и с ростом скорости кровотока в уже существующих сосудах — мы продолжаем изучение этого вопроса. Архитектоника сосудистой сети в норме и при патологии, визуализируемая на ОКТ МА-изображениях, идентична архитектонике сосудистой сети, визуализируемой на флуоресцентных изображениях (рис. 2В, Е), что свидетельствует о корректности получаемых с помощью ОКТ МА данных и возможности отличать нормальную ткань от ткани с патологией, используя этот метод.

ОКТ-эластография

Пример использования разработанного нами метода построения карт деформации с помощью ручного оперирования зондом. При обследовании лабораторных животных in vivo показан на рис. 3. На рис. 3А и рис. 3Б приведены структурное и эластографическое изображения ткани уха здорового животного. На структурном изображении (рис. 3А) видно, что ткань по всему размеру кадра морфологически однородна и характеризуется равномерным уровнем рассеяния ОКТ-сигнала, в результате чего на эластографической карте распределение деформации также ожидаемо однородно (рис. 3Б). На структурном изображении ткани уха с привитой опухолью (рис. 3В) эта же область выглядит утолщенной в 2,0-2,5 раза и характеризуется пониженным уровнем рассеяния зондирующего сигнала. На эластографической карте (рис. 3Г) область опухоли отчетливо проявляется в виде контрастной по уровню деформаций зоны по отношению к окружающей ткани.

Изучение естественного роста опухоли СТ26 на ухе мыши

Развитие опухоли СТ26 на ухе исследовали с помощью КП ОКТ и ОКТ МА. Показано, что с развитием опухоли на КП ОКТ-изображениях сигнал резко падает и достигает минимальных значений на 14-й день после прививки опухоли, при этом также снижается глубина проникновения сигнала (рис. 4, верхний ряд). На ОКТ МА-изображениях видно, что по мере увеличения размеров опухоли заметно увеличивается и количество сосудов (рис. 4, нижний ряд).

Ответ опухоли на фотодинамическую терапию

Анализ гистологических препаратов

В результате ФДТ происходит как повреждение клеточного компонента опухоли, так и расстройство ее кровообращения. На второй день после проведения терапии выявляются очаги некроза, занимающие порядка 60 % площади всей опухоли. Наряду с некрозом ткани отмечено расстройство кровообращения: стаз и сладж-синдром, тромбозы и кровоизлияния.

Анализ КП ОКТ-изображений

Предполагается, что повреждающее действие ФДТ как на опухолевые клетки, так и на сосудистый компонент опухоли должно отражаться на оптических свойствах опухоли. На рис. 5 продемонстрированы карты фактора деполяризации для опытной (ФДТ) и контрольной групп животных. Так, в контрольной группе опухоль характеризуется низкими значениями фактора деполяризации (рис. 5А), что говорит о низкой способности ткани к кросс-рассеянию. В опухолях после ФДТ на картах ИФД видно увеличение кросс-рассеяния (рис. 5Б): значения ИФД возрастают с 0,020 ± 0,007 до 0,036 ± 0,013. Можно предположить, что преобладание в общей массе опухоли участков некроза, морфологически представляющих собой скопления клеток воспаления и разрушенных коллагеновых волокон и опухолевых клеток, приводит к увеличению центров кросс-рассеяния и увеличению значения ИФД.

Анализ ОКТ МА-изображений

ОКТ МА-мониторинг состояния сосудистой сети в опухоли в первые часы после ФДТ выявляет мгновенную реакцию сосудистого компонента на облучение: подавляющее большинство сосудов не визуализируется методом ОКТ МА (рис. 6Б). Через 24 ч после ФДТ сосуды в опухоли практически не визуализируются (рис. 6В). Полученный результат свидетельствует о том, что при расстройствах кровообращения, приводящих к существенному замедлению или остановке кровотока, сосуды на ОКТ МА-изображениях не видны. На флуоресцентных изображениях сосудистая сеть также не визуализируется (рис. 6Д).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В данной работе представлено первое комплексное исследование нормальной и патологически измененной ткани методом мультимодальной ОКТ: были получены и проанализированы как структурные ОКТ-изображения, так и ОКТ-изображения сосудистой сети и карты распределения жесткости — эластографические ОКТ-изображения. Показана принципиальная возможность применения ММ ОКТ для оценки эффективности противоопухолевой терапии. Другие группы исследователей изучают отдельные направления ОКТ. Например, ОКТ-эластографией занимаются во многих научных центрах США с начала 2000-х гг., обосновывая ее применение в офтальмологии [14, 15, 20, 21]. Ведущей в этой области является группа профессора D. Sampson в Австралии [12, 22]. Лидирующие позиции в области визуализации кровотока в тканях, в первую очередь сети капиллярных сосудов, методами ОКТ занимают научные группы под руководством М. Leahy [23], R. Wang [24], A. Vitkin [25]. Также с помощью ОКТ изучали сосудистую реакцию в ответ на ФДТ [26, 27].

К настоящему моменту показано применение метода ОКТ для визуальной оценки структурных изменений опухолей кожи после ФДТ и определения границ опухоли в течение нескольких месяцев после лечения [28, 29]. Тем не менее, некоторые изменения клеточного состава опухолей не могут быть обнаружены невооруженным глазом на ОКТ-изображениях, и количественная оценка ОКТ-изображений обеспечивает более надежный результат. Ранее этот подход позволил значительно повысить точность диагностики для ряда задач [18]. Вычисление ИФД для оценки ответа опухоли на ФДТ помогает не только объективно оценить изображения, но и понять механизм гибели клеточного и стромального компонентов опухоли и роли в этом клеток воспаления.

ММ ОКТ-мониторинг роста опухолевого узла выявил постепенное развитие сосудистой сети. Очевидно, что степень васкуляризации опухоли может повлиять на выбор и качество противоопухолевой терапии: в хорошо васкуляризированных опухолях фотосенсибилизатор накопится в большей концентрации и для таких опухолей можно с успехом применять методы ФДТ, воздействующие на сосуды.

Нами показано, что одновременное изучение опухолевой ткани тремя модальностями ОКТ дает возможность получать информацию как о структуре ткани, состоянии коллагеновых волокон и кровеносных сосудов, так и о ее жесткостных свойствах. Совокупность этих сведений важна для правильной оценки ответа опухоли на противоопухолевую терапию. На наш взгляд, особое внимание следует уделять изучению исходного состояния опухоли до лечения, т. к. это может повлиять на выбор тактики лечения. Например, плохо васкуляризированные опухоли, скорее всего, гиспоксичны, и лучевая и фотодинамическая терапия окажутся малоэффективными, а химиопрепараты, вероятно, плохо накопятся в патологическом очаге, и потребуется таргетная доставка препаратов.

ВЫВОДЫ

В работе показана перспектива применения мультимодальной оптической когерентной томографии в решении задач по индивидуальному подбору противоопухолевой терапии на примере фотодинамической терапии. КП ОКТ дает информацию о структуре ткани и состоянии коллагеновых волокон на основе анализа рассеивающих и поляризационных свойств ткани, выявляет области некроза. ОКТ МА позволяет в реальном времени визуализировать не только архитектонику сосудистого русла в нормальной ткани и при опухолевом росте, но и оценить функциональное состояние сосудов, в частности, можно наблюдать за реакцией сосудистого компонента опухоли на терапию сразу после ее проведения и при необходимости корректировать параметры терапевтического воздействия в случае отсутствия сосудистой реакции. В работе впервые апробирован робастный (устойчивый к помехам) метод получения эластографических изображений, позволяющий получать карты деформаций in vivo при ручном оперировании ОКТ-зондом, что особенно важно для клинических исследований. Проведение комплексной оценки функционального состояния тканей методом ММ ОКТ открывает новые горизонты в индивидуализации лечения онкологических заболеваний.