Приобретение лекарственной устойчивости штаммами возбудителя туберкулеза Mycobacterium tuberculosis — одна из самых значимых проблем фтизиатрии, в том числе в России, где ежегодно фиксируется 115 тыс. случаев заболевания туберкулезом (80 случаев на 100 тыс. человек), а 20 % всех впервые выявленных и 50 % ранее получавших противотуберкулезную терапию пациентов инфицированы штаммами с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) [1]. Таким образом, для совершенствования схем терапии, критически важным является поиск и определение особенностей наиболее распространенных на территории России штаммов M. tuberculosis.

Изоляты микобактерий туберкулеза относят к различным линиям, каждая из которых имеет определенное географическое происхождение [2] и характеризуется набором филогенетических маркеров, влияющих также на фенотип штамма [3]. В России наиболее часто встречаются представители линии Beijing, которая характеризуется повышенной трансмиссивностью, вирулентностью, частотой мутаций в геноме и другими свойствами, способствующими его распространению [4].

В недавних исследованиях, проведенных в России [5], были обнаружены штаммы сублинии Beijing-B0/W148. Они характеризуются повышенной (по отношению к родительской линии Beijing) вирулентностью и множественной лекарственной устойчивостью (практически полным отсутствием лекарственно чувствительных штаммов в данной сублинии). Mokrousov и соавт. назвали Beijing-B0/W148 «успешным клоном» M. tuberculosis [5].

Для определения принадлежности штамма/изолята M. tuberculosis к какой-либо линии применяют различные методы генотипирования: метод полиморфизма длин рестрикционных фрагментов мобильного элемента IS6110 (IS6110 restriction fragment lengh polymorphism, RFLP), сполиготипирование [6], методы, основанные на маркерных однонуклеотидных полиморфизмах (single nucleotide polymorphism, SNP) генов «домашнего хозяйства» (housekeeping genes) [7] и систем токсин–антитоксин II типа [8]. Все эти методы различаются по стоимости и трудоемкости исследования, а также по своей дискриминирующей способности. Одним из наиболее быстрых, дешевых, но в то же время обладающих наибольшей дискриминирующей способностью является молекулярный метод генотипирования, основанный на анализе количества распределенных по геному M. tuberculosis повторов — MIRU-VNTR (mycobacterial interspersed repetitive units – variable number of tandem repeats) [9].

Ранее нами была проанализирована коллекция ДНК из 64 изолятов M. tuberculosis выделенных от пациентов Центрального НИИ туберкулеза (Москва). Изоляты были типированы методом сполиготипирования, показавшим, что 70,3 % из них относятся к линии Beijing [10]. Для определения доли «успешных клонов» Beijing-B0/W148 среди штаммов линии Beijing, а также для более детального анализа филогенетической структуры коллекции нами проведено типирование доступных для анализа 46 образцов ДНК коллекции по 24 локусам MIRU-VNTR. Результаты представлены в этой работе.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 

Коллекция ДНК клинических изолятов M. tuberculosis 

В работе использовали коллекцию ДНК клинических изолятов M. tuberculosis, ранее детально описанную Maslov и соавт. [10]. В частности, были установлены сполиготипы изолятов и их профиль лекартсвенной устойчивости к 8 противотуберкулезным препаратам первого и второго ряда. На основании этого изоляты были разделены на две группы: 1) изоляты, устойчивые хотя бы к одному противотуберкулезному препарату (41 изолят); 2) контрольная группа лекарственно-чувствительных изолятов (23 изолята). В данной работе для анализа были доступны 46 изолятов, из которых к каждой группе относилась половина.

Генотипирование клинических изолятов M. tuberculosis

Генотипирование клинических изолятов проводили по 24 локусам MIRU-VNTR согласно стандартному протоколу [11]. Синтез праймеров для амплификации, описанных в [9], выполнила компания «Синтол» (Россия). Амплификацию проводили в 96-луночных планшетах с объемом лунок 0,2 мл (Bio-Rad, США) с набором для проведения ПЦР «Амплификация» (Dialat, Россия) по протоколу, описанному в [9], на амплификаторе T100 (Bio-Rad, США). Полученные фрагменты разделяли в 2 % агарозном гель-электрофорезе в 1x трис-ацетат-EDTA (TAE) буфере (трис-ацетат — 40 мМ, EDTA — 1 мМ, pH 7,6). Полученные результаты интерпретировали с помощью веб-приложения MIRU-VNTRplus [9, 12].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Итоговое распределение изолятов M. tuberculosis по профилю MIRU-VNTR с использованием программы MIRU-VNTRplus было следующим: 60,9 % изолятов относятся к линии Beijing, 13,0 % — к LAM, 13,0 % — к T1 и T2, 4,3 % — к URAL, по одному изоляту (2,2 %) — к линиям Cameroon, S и NEW-1. Для одного изолята не удалось определить принадлежность к определенной линии. В изоляте 13-2078 были обнаружены два аллеля локуса QUB26 — 1 и 7, что может быть свидетельством смешаной инфекции [13].

На основе полученных MIRU-VNTR профилей мы построили дендрограмму (рисунок). На ней четко кластеризуются 17 изолятов, относящихся к сублинии B0/W148 (изолят 13-2078 представляет собой смесь двух штаммов, но оба относятся к сублинии B0/W148), составляя, таким образом, 60,7 % всех изолятов линии Beijing. Стоит отметить, что все они относятся к группе А — лекарственно-устойчивым изолятыам, при этом 15 из них (88,2 %) обладают МЛУ, из которых, в свою очередь, 3 (20,0 %) обладают широкой лекарственной устойчивостью (ШЛУ).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 

В предыдущей работе [10] мы провели генотипирование изолятов M. tuberculosis с использованием сполиготипирования. В результате изоляты разделились на 6 групп: 60,9 % изолятов принадлежат к линии Beijing, 21,7 % — к T1 и T2, 6,5 % — к LAM9, 6,5 % — к H4 (доли указаны для 46 изолятов, исследованных в данной работе). Пять изолятов имели уникальный генотип [10]. Это могло произойти в связи со случайной делецией или инсерцией спейсеров, что является довольно частым явлением из-за высокой вариабельности данного региона.

Проведенный анализ 24 локусов MIRU-VNTR позволил уточнить ранее полученные данные. Так, удалось отнести к различным линиям 4 изолята, ранее отнесеннные к Т-кластеру (два — к LAM, по одному — к S и Cameroon), и 3 изолята линии H4 (два — к Ural, один — к NEW1). В то же время удалось выявить представителей сублинии Beijing B0/W148 среди изолятов линии Beijing. Таким образом, MIRU-VNTR являтся более предпочтительным методом генотипирования M. tuberculosis в сравнении со сполиготипированием за счет более высокой разрешающей способности и возможности установления случаев смешанной инфекции, хотя наилучшие результаты могут быть получены только при комбинировании различных методик генотипирования.

Все изоляты сублинии Beijing-B0/W148 оказались лекарственно-устойчивыми, преимущественно МЛУ (88,2 %), что характерно для этой группы и согласуется с данными, полученными ранее [5, 14], Этот факт дополнительно подтверждает «успешность» данной сублинии. Открытым остается вопрос о факторах, способствующих отбору именно этой филогенетической группы. Видимо, повышенная мутационная изменчивость привела к функциональным перестройкам, позволившим повысить вирулентность и выживаемость данной группы [4]. Ответы на эти вопросы предстоит получить в будущих исследованиях.

ВЫВОДЫ

Оценка и эпидемиологический контроль за распространением успешных линий M. tuberculosis являются важнейшейшими задачами в рамках организации эффективной диагностики и лечения больных туберкулезом. Результаты, полученные в исследовании, позволяют говорить о тенденции распространения штаммов сублинии Beijing-B0/W148, для которых характерен МЛУ-фенотип, дополняют существующие эпидемиологические данные для центрального региона России, а также подчеркивают важность применения различных методик генотипирования для наиболее полной характеристики клинических изолятов M. tuberculosis.