Актуальной проблемой современной хирургии является лечение гнойных ран, что связано с распространенностью ран различной этиологии, частыми гнойными осложнениями, высокой летальностью, значительными затратами на лечение [1, 2]. По данным некоторых авторов, в структуре хирургических заболеваний гнойные осложнения составляют 30–35 %, а смертность от них достигает 25 % [3, 4, 5].

Существует много методов лечения гнойных ран [6, 7, 8, 9, 10, в том числе разрабатываются и внедряются новые методы: гипербарическая оксигенация, лазерная терапия, магнитотерапия, управляемая абактериальная среда и др. [11, 12, 13, 14, 15]. Однако основным является метод лечения ран под повязкой — благодаря его доступности, простоте и экономичности [16, 17, 18].

Следует отметить, что массовое и бесконтрольное применение антибактериальных препаратов приводит к появлению микрофлоры, малочувствительной или нечувствительной к ним. Этот факт имеет особое значение при сложных хронических заболеваниях, например при лечении трофических язв у больных сахарным диабетом, где длительная антибактериальная терапия является обязательной [19, 120]. В таких случаях перспективно применение антимикробных пептидов, которые считаются альтернативой традиционным антибиотикам, а также использование биостимуляторов с ранозаживляющей активностью, к которым относится каланхоэ.

Многие растения рода Kalanchoe являются лекарственными: их сок используется для лечения ожогов, кожных ран, язв; они применяются как биостимуляторы при пересадке кожи. В соке каланхоэ содержатся флавоноиды, включая буфадиенолы, лектины, обладающие митогенной активностью в отношении лимфоцитов, витамины, органические кислоты, полисахариды, антиоксиданты и микроэлементы [21, 22]. В настоящее время получены трансгенные растения — биореакторы для получения фармацевтических субстанций — на основе видов K. daigremontiana [23, 24], K. laciniata [25] и K. blossfeldiana [26]. Наиболее ценным для фармакологии считается каланхоэ перистое (K. pinnata). В 2012 г. был разработан метод генетической трансформации каланхоэ перистого, в результате которой в растении экспрессируется ген цекропина P1 [27].

Цекропин P1 — секреторный фактор свиной нематоды Ascaris suum; относится к группе линейных α-спиральных пептидов, не содержащих цистеина [28]. В отличие от цекропинов насекомых он состоит из одной длинной положительно заряженной α-спирали, имеющей в своем составе практически все аминокислотные остатки. В экспериментах in vitro цекропин P1 высокоактивен против патогенных грамотрицательных и грамположительных бактерий [29], грибов [30] и некоторых опухолевых клеток [31], однако сведения о его антимикробной активности in vivo в литературе до настоящего времени не приводились.

В связи с вышеизложенным целью нашей работы являлась оценка эффективности фармакотерапии экстрактом листьев каланхоэ перистого с цекропином P1 раневого процесса на модели гнойной раны у крыс с дополнительным внесением в рану культуры Staphylococcus aureus.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эксперименты проводили на крысах линии Wistar в возрасте 4 мес и массой 200–220 г, прошедших карантинирование в условиях вивария НИИ экологической медицины Курского государственного медицинского университета. Для исследования были взяты здоровые животные. Их содержали в стандартной экспериментальной биологически чистой комнате с температурой воздуха 22–24 ^°С и при цикличном освещении (по 12 ч света и темноты). Все крысы получали гранулированный корм и фильтрованную водопроводную воду. Манипуляции проводили в одно и то же время во второй половине дня. Наркотизацию животных осуществляли внутрибрюшинным введением водного раствора хлоралгидрата в дозе 300 мг/кг веса, выведение из эксперимента — его передозировкой. В исследовании соблюдали принципы, изложенные в Конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (Страсбург, 1986 г.).

Животных распределили по группам путем стратифицированной рандомизации со стратификацией по массе тела, а также проводимым операциям и манипуляциям. Из животных с моделированной гнойной раной (с дополнительным внесением в нее культуры S. aureus) были сформированы следующие группы: группа 1 (контрольная): животные, которым производилась обработка раны 3 % раствором перекиси водорода (n = 10); группа 2: животные, которым производилась обработка раны 3 % раствором перекиси водорода с последующей обработкой 10 % раствором цефазолина (n = 10); группа 3: животные, которым производилась обработка раны 3 % раствором перекиси водорода с последующей обработкой соком каланхоэ (n = 10); группа 4: животные, которым производилась обработка раны 3 % раствором перекиси водорода с последующей обработкой соком каланхоэ с цекропином P1 (n = 10).

Животным моделировали гнойную рану под наркозом в стерильных условиях. Для этого на выбритом от шерсти участке спины площадью 20 × 20 мм, обработанном антисептиком, иссекали кожу с подкожной клетчаткой. В полученную рану вводили 1 мл раствора, содержащий 1 млрд микробных тел суточной культуры S. aureus 592. Для стандартизации условий лечения, предупреждения деформации раны, высыхания, загрязнения раневой поверхности и укусов другими животными над раной подшивали к коже марлевую повязку. Через 48 ч у всех животных формировалось нагноение раны со всеми характерными признаками воспаления. После снятия швов марлевую повязку удаляли, эвакуировали гной из раны и производили ее обработку один раз в день ежедневно в течение 14 суток.

Гистологическое изучение раневых биоптатов производили на 3, 10 и 14 сутки от начала лечения после выведения подопытного животного из эксперимента путем передозировки наркоза (по 3 животных на каждое выведение). Забор материала осуществляли, иссекая участок мягких тканей дна и прилежащего края раны лезвием. Взятый материал сразу фиксировали в 10 % растворе нейтрального формалина с последующей проводкой по восходящим спиртам и заливкой в парафин по стандартной методике. Приготовленные парафиновые срезы окрашивали гематоксилином и эозином.

Микроскопирование и микрофотосъёмку проводили с помощью оптической системы, состоявшей из микроскопа Leica CM E (Leica Microsystems, Германия) и окуляр-камеры «Микромед DCM-510 SCOPE» («Наблюдательные приборы», Россия) на увеличениях х40, х100, х200 и х400 крат с документированием снимков в программе Future Win Joe (Future Optics, Китай), входящей в комплект поставки окуляр-камеры. При оценке гистологических срезов обращали внимание на выраженность воспалительных реакций, сроки появления грануляционной ткани, возникновение краевой эпителизации, а также структурную полноценность вновь образованного эпителия. Также исследовали клеточный состав ткани, непосредственно прилегающей к краям раны, а на поздних сроках — новообразованной ткани. По кариологическим признакам дифференцировали клетки волокнистой соединительной ткани. Процентное соотношение клеток различных типов рассчитывали после подсчета 100 клеток в нескольких не пересекающихся полях зрения (не менее 10).

Статистический анализ полученных данных осуществляли в программе Microsoft Excel 10.0. Рассчитывали среднее значение (M) и ошибку среднего (m) для всех показателей. Использовали двухвыборочный t-тест с различными дисперсиями для сравнения значений показателей по группам животных и определения достоверности различий между ними. Статистически значимыми считали различия при p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Результаты лечения в группе 1 (контроль)

3 сутки

Гнойные раны характеризовалась признаками острого гнойного воспаления. Поверхность ран была покрыта тканевым детритом, с фибринно-лейкоцитарными массами, под которыми определялись скопления лейкоцитов в состоянии распада и геморрагические участки. Ткани околораневой зоны были отечными, с выраженными признаками лейкоцитарной инфильтрации. Отек и инфильтрация проникали глубоко, до мышечной ткани. Эпителий по краям ран был утолщен, дезорганизован. Коллагеновые волокна в пределах дермы были набухшими, сосуды дермы — полнокровными и расширенными (рис. 1, А).

10 сутки

Дефект тканей был заполнен гнойно-некротическими массами, эпидермис по краям ран утолщен. На уровне дермы определялась выраженная лейкоцитарная инфильтрация, встречались макрофаги и тучные клетки (таблица), интерстициальный отек распространился в глубокие слои дермы, до мышечных волокон (рис. 1, Б).

14 сутки

В ранах сохранялась глубокая лейкоцитарная инфильтрация, некротические массы заполняли дефект тканей. По краям ран определялась отечная дерма с истонченным слоем эпидермиса. В подлежащей мышечной ткани сохранялся воспалительный отек и инфильтрация. На уровне дна ран начинала формироваться грануляционная ткань, в которой встречались микроабсцессы, заполненные лейкоцитами (рис. 1, В). 

Результаты лечения в группе 2 (10 % раствор цефазолина) 

3 сутки

В ранах гистологически определялись признаки острого гнойного воспаления. В зоне раневого дефекта отмечалось некротическое содержимое, воспалительная инфильтрация в пределах дермы была представлена не только лейкоцитами, но и единичными нейтрофилами. В поле зрения визуализировались многочисленные макрофаги (рис. 1, Г).

10 сутки

Наблюдали активный рост и организацию соединительной ткани в пределах дермы. Данные процессы протекали в присутствии клеток фибробластического ряда и макрофагов (таблица). Отмечалась выраженная пролиферация и дифференцировка клеток эпителия (рис. 1, Д).

14 сутки

Определялись участки сформированного эпидермиса с четкой дифференцировкой слоев, но толщина превышала уровень интактной кожи. На уровне дермы имелась зрелая грануляционная ткань. В глубоких слоях определялись единичные микроочаги воспалительной инфильтрации. Восстановительные процессы в условиях инфицирования характеризовались образованием значительного количества грануляционной ткани, которая замещалась фиброзной, и наличием на месте дефекта кожи большого количества разнонаправленно расположенных коллагеновых волокон (рис. 1, Е).

Результаты лечения в группе 3 (сок каланхоэ)

3 сутки

В этой группе морфологическая картина раневого процесса была схожей с таковой в контрольной группе и группе 2. Тучные клетки активно вовлекались в процесс заживления, о чем свидетельствовало повышение общего количества клеток в околораневой зоне. В зоне раневого дефекта сохранялись остатки гнойно-некротического содержимого (рис. 2, А).

10 сутки 

Краевой эпидермис начинал перемещение от периферии к дну раны, где появлялись очаги грануляционной ткани. Тонкие единичные коллагеновые волокна были хаотично расположены в окружении клеточного компонента с преобладанием фибробластов и макрофагов (таблица, рис. 2, Б).

14 сутки

В некоторых случаях отмечалась полная эпителизация зоны дефекта. В пределах дермы имелась грануляционная ткань различной степени зрелости. Коллагеновые волокна были окружены фибробластами, имели расположение преимущественно параллельное поверхности кожных покровов (рис. 2, В).

Результаты лечения в группе 4 (сок каланхоэ с цекропином P1)

3 сутки

Полости ран были заполнены некротическими массами. Ткани содержали большое количество нейтрофилов. На уровне дермы определялись выраженный отек и расширенные капилляры (рис. 2, Г).

10 сутки

Регенераторные процессы характеризовались локализацией воспалительной реакции, чему способствовало образование демаркационного вала из нейтрофилов. Для воспалительного инфильтрата был характерен четко выраженный клеточный полиморфизм. Грануляционная ткань покрывала дно раны. На фоне активного ангиогенеза улучшалась васкуляризация тканей в околораневой зоне, уменьшались отек и воспалительная инфильтрация (рис. 2, Д).

14 сутки

Раневой дефект был заполнен многочисленными коллагеновыми волокнами, окруженными фибробластами. На фоне хаотичного расположения волокнистого компонента отмечалось преобладание горизонтального направления волокон. Эпителий нарастал на грануляционную ткань. Толщина эпителия превышала уровень интактной кожи (рис. 2, Е).

Сравнение результатов лечения в группах

Гистологическое исследование на 3 сутки наблюдения не выявило существенных различий в результатах лечения по группам. Однако на 10 сутки для ран крыс контрольной группы была отмечена незавершенность фазы экссудации, группы 2 — переход фазы экссудации в фазу регенерации, а групп 3 и 4 — покрытие грануляционной тканью.

На 14 сутки в срезах раневых биоптатов крыс групп 3 и 4 количество фибробластов значительно превышало количество гранулоцитов и макрофагов (таблица), что свидетельствовало об активной регенерации. Следует также отметить, что наиболее эффективной регенерация была в группе 4 (дополнительная обработка ран соком каланхоэ с цекропином P1), в которой все раны к концу опыта были полностью покрыты новым эпидермисом.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Получение трасгенных растений K. pinnata, в которых экспрессируется ген цекропина P1 с накоплением пептида в цитоплазме клеток, описано в ряде статей, начиная с 2007 г. [30]. Опубликованы сведения об уровне накопления цекропина P1 и его действии на фитопатогены и стандартные бактериальные культуры in vitro. Тем не менее ни одна из этих работ не содержит данных о терапевтической эффективности сока трансгенных растений каланхоэ при лечении инфекций у животных. Между тем, наличие у K. pinnata собственной ранозаживляющей, иммуномодулирующей и ремоделирующей активности [32] позволяет ожидать усиления антимикробного эффекта цекропина P1 при воздействии сока трасгенных растений на патогены in vivo.

Полученные нами результаты исследования свидетельствуют о том, что применение сока каланхоэ ускоряет переход от первой фазы воспалительного процесса к регенерации. По сравнению с контролем быстрее спадает отек, происходит очищение раны от некротических масс, раньше появляются грануляции и начинается эпителизация раны. Разнообразие клеточного состава и наличие клеток фибробластического ряда различных стадий зрелости говорит о стимулирующем воздействии изучаемых соединений на пролиферативную и функциональную активность клеток грануляционной ткани. Терапевтический эффект сока каланхоэ с цекропином P1 наиболее выражен по отношению к контролю на поздних стадиях заживления раны. Результаты лечения ран дополнительной обработкой 10 % раствором цефазолина и соком каланхоэ были лучше, чем в контрольной группе, но хуже, чем при дополнительной обработке соком каланхоэ с цекропином P1: несмотря на практически полное восстановление эпидермиса по краям ран в группах 2 и 3, на отдельных участках частично сохранялся струп, а количество различных клеточных элементов в грануляционной ткани указывало на меньшую степень ее зрелости при сравнении с грануляционной тканью в группе 4. Выявленное нами полное закрытие дефекта новообразованным эпидермисом в группе с использованием сока каланхоэ с цекропином P1, а также появление производных кожи свидетельствуют не только об ускорении процессов регенерации, но и о полноценном восстановлении кожи за счет более активной миграции и пролиферации эндотелиоцитов и усиления ангиогенеза.

Следует отметить, что эффективность антимикробного действия сока трансгенного каланхоэ на стафилококк in vivo существенно превысила ту, которой можно было бы ожидать на основании известных данных об антимикробной активности этого препарата на батериальных культурах in vitro [30]. По-видимому, этот эффект обусловлен сочетанием антимикробного действия цекропина P1 и эндогенных буфадиенолов сока K. pinnata. Кроме того, существенный вклад в ускоренную элиминацию патогенов из раны под действием сока трансгенных растений может вносить иммуностимулирующая активность гемагглютинирующих лектинов K. pinnata [33]. Подобно конканавалину А или фитогемагглютинину, эти лектины способны ускорять размножение лимфоцитов, в том числе специфичных к антигенам патогенов, которые скапливаются вблизи очага инфекции. Этот эффект на фоне подавления физиологических функций бактерий цекропином P1 и антимикробными факторами сока может приводить к существенному ускорению и усилению выработки антител. Наконец, ускорять элиминации патогенов из раны могут более выраженная васкуляризация и ремоделирование рубцовой ткани под действием неидентифицированных компонентов сока каланхоэ. Эти эффекты способны ускорить транспорт клеток и растворимых факторов иммуной системы к очагу инфекции, усиливая защитные реакции.

ВЫВОДЫ

В исследовании показана высокая эффективность фармакотерапии соком трансгенного каланхоэ перистого (с цекропином P1) раневого процесса на модели гнойной раны у крыс с дополнительным внесением в рану культуры S. aureus. Полученные данные позволяют рекомендовать субстанцию для широкого клинического изучения. Сок трасгенного каланхоэ наиболее перспективен в качестве средства для лечения трофических язв у пациентов с сахарным диабетом. Для этого типа наружных поражений характерна сочетанная инфекция рядом патогенов на фоне сниженного иммунитета, при этом длительное применение антибиотиков ограничено выработкой устойчивости бактерий к ним.

Использование для лечения наружных микробных инфекций цельного сока трансгенного K. pinnata вместо очищенного из него атимикробного пептида позволит не только снизить затраты на очистку лекарственной субстанции, но и усилить лечебное действие цекропина P1. Таким образом, K. pinnata может рассматриваться как перспективный экономически эффективный и технологически доступный биореактор для получения линейки субстанций антимикробного назначения петидной и особенно белковой природы, в том числе альфа-литической протеазы, лизостафина или гирудина.