Ежегодно только в США по крайней мере 2 миллиона человек оказываются инфицированы бактериями, устойчивыми к антибиотикам, и по меньшей мере 23 000 человек умирают от устойчивых бактериальных инфекций [1]. Растущая антибиотикорезистентность патогенов человека является серьезной клинической проблемой с важными экологическими последствиями. По данным Antibiotic Resistance Genes Database (ARDB) [:lit_12], в настоящее время насчитывается 13 293 гена устойчивости микроорганизмов к антибиотикам. Возможность обмена генетической информацией между бактериями в смешанных популяциях обусловливает существование множества потенциальных сложных путей распространения генов резистентности [3]. 

Кишечник человека, содержащий наибольшее количество клеток (около 10¹⁴) и видов (около 1000) микроорганизмов [4], образует динамический резервуар генов устойчивости к антибиотикам (резистому) [5]. Лечение с использованием антибактериальных агентов оказывает значительное влияние на резистому кишечника и приводит к росту интенсивности горизонтального переноса генов и селекции устойчивых форм [6]. Анализ генов устойчивости представителей кишечной микробиоты показывает, что комменсальные бактерии желудочно-кишечного тракта могут быть резервуарами генов устойчивости для других видов бактерий, в том числе патогенных [7].

Для изучения проблемы устойчивости к антибиотикам используют высокотехнологичные методы секвенирования ДНК нового поколения, методы биоинформатики и аналитической химии, что позволяет проводить идентификацию более 20–30 кластеров генов, связанных с устойчивостью к антибиотикам [8]. В Центре по изучению генома и системной биологии Вашингтонского университета был проведен биоинформатический анализ распространения генов устойчивости к 18 клинически значимым антибиотикам. Были выявлены гены устойчивости к двум из наиболее широко используемых классов антибиотиков в клинике и в сельском хозяйстве — β-лактамам и тетрациклинам [9].

Серьезную угрозу для антимикробной терапии представляют аминогликозидфосфотрансферазы (Aph) [10].  Гены этих ферментов впервые были обнаружены в плазмидах и мобильных элементах клинических штаммов грамотрицательных и грамположительных бактерий [11]. Проведенный филогенетический анализ Aph клинических штаммов и штаммов-продуцентов аминогликозидных антибиотиков [12] показал, что в зависимости от положения гидроксильной группы антибиотика, модифицируемой ферментом, различают 7 подсемейств аминогликозидфосфотрансфераз: Aph(2''), Aph(3'), Aph(3''), Aph(4), Aph(6), Aph(7'') и Aph(9).

 Гены aph аннотированы в геномах многих бактерий, в том числе непатогенных штаммов бактерий микрофлоры кишечника, от которых они могут передаваться клиническим штаммам [13]. Анализ метагеномной ДНК кишечника новорожденных показал, что уже в это время кишечник является резервуаром многочисленных генов резистентности к аминогликозидам и β-лактамам [14].

При сравнении метагеномов кишечника 832 человек из десяти разных стран (Англии, Финляндии, Франции, Италии, Норвегии, Шотландии, США, Японии, Китая и Малави) было установлено, что существенное влияние на состав генов устойчивости оказывало географическое происхождение человека [15].

В различных лабораториях мира были проведены исследования распространения генов aph. Ген aac(6')-Ie-aph(2'')-Ia являлся наиболее распространенным геном устойчивости к аминогликозидам у энтерококков и был выявлен в 26 из 27 изолятов, выделенных из организмов пациентов иранской больницы [16]. При эпидемиологическом исследовании 534 клинических штаммов, выделенных в японской больнице, по распределению 12 генов аминогликозид-модифицирующих ферментов в трех штаммах Enterococcus faecium был идентифицирован ген aph(2")-Ie, в трех штаммах E. faecalis, E. faecium и E. avium — ген ant(9)-Ia. Нуклеотидные последовательности генов ant(9)-Ia из этих трех энтерококков были идентичны генам Staphylococcus aureus и были расположены в транспозоне Tn554 [17]. Поскольку аминогликозиды часто используются для лечения стафилококковых инфекций, исследовалась распространенность устойчивости к аминогликозидам среди метициллин-резистентных штаммов S. aureus, выделенных из организмов пациентов иранской клиники. Были обнаружены гены aac(6')-Ie-aph(2"), aph(3')-IIIa и ant(4')-Ia среди 134 (77,0 %), 119 (68,4 %) и 122 (70,1 %) изолятов соответственно [18].

В связи с этим актуальна задача идентификации генов аминогликозидфосфотрансфераз в метагеномах желудочно-кишечного тракта жителей России.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Пробоподготовка и секвенирование ДНК микробиома 

Объектом исследования была кишечная микробиота 11 здоровых людей разного возраста и пола — жителей Москвы и Твери. Отбирали пробы фекалий, используя стандартные методики [19]. До использования в экспериментах образцы хранили замороженными (–80 °С).

Тотальную бактериальную геномную ДНК выделяли из навесок замороженного кала при помощи набора реагентов QIAamp Fast DNA Stool Mini kit (Qiagen, Германия) по протоколу, рекомендованному производителем. Использовали версию протокола с условиями лизиса для преимущественного выделения ДНК микроорганизмов Protocol: Isolation of DNA from Stool for Pathogen Detection (Qiagen). Концентрацию выделенной ДНК определяли с помощью прибора Qubit (Invitrogen, США). Полученная геномная ДНК была фрагментирована на ультразвуковом фрагментаторе Covaris M220 (Covaris, США) до размера фрагментов 100–700 пар оснований (средний размер — ~350 п. о.).

Библиотеки для секвенирования готовили с использованием набора реагентов NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina (NEB, Великобритания). Для секвенирования были отобраны фрагменты длиной от 250 до 500 п. о., включая адаптерные последовательности. Библиотеки были проверены при помощи анализатора Agilent TapeStation (Agilent Technologies, Германия) и смешаны эквимолярно. Последовательности адаптеров, использованных при подготовке библиотек: Read1 (AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACNNNNNNATCT CGTATGCCGTCTTCTGCTTG) и Read2 (AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAG TGTAGATCTCG GTGGTCGCCGTATCAT), где NNNNNN — шестинуклеотидный индекс, уникальный для каждого образца. После контроля качества и определения количества библиотек при помощи количественной полимеразной цепной реакции пул библиотек был секвенирован на одной дорожке прибора Illumina HiSeq 4000 (101 цикл с каждого конца фрагментов) с использованием реактивов HiSeq 4000 SBS sequencing kit version 1 (Illumina, США). Файлы FASTQ были получены с помощью программы bcl2fastq v2.17.1.14 Conversion Software (Illumina). Формат записи строки данных о качестве — Phred 33. Полученные метагеномы были депонированы в базе данных Sequence Read Archive (SRA) NCBI. Описание полученных библиотек представлено в табл. 1.

Контроль качества метагеномных библиотек и сборка

Контроль качества полученных метагеномных библиотек проводили при помощи программы FastQC [20]. Тримминг проводили при помощи программы trimmomatic [21]. Фильтрация контаминации ридами, полученными из человеческого генома, проводили методом картирования метагеномных ридов на сборку генома человека. Для картирования использовали программа Bowtie2 [22]. Сборку метагеномных ридов до уровня контигов проводили при помощи программы SPAdes [23]. Описание полученных сборок представлено в табл. 2.

Составление каталога генов аминогликозидфосфотрансфераз

На основе литературных данных [12] был сформирован каталог генов аминогликозидфосфотрансфераз, найденных в клинических штаммах бактерий Acinetobacter baumannii, Alcaligenes faecalis, Bacillus circulans, Burkholderia pseudomallei, Campylobacter jejuni, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Enterococcus casseliflavus, Enterococcus faecium, Legionella pneumophila и Pseudomonas aeruginosa. Всего в каталог вошел 21 ген. Также был создан каталог аминокислотных последовательностей, кодируемых отобранными генами аминогликозидфосфотрансфераз.

Анализ метагеномов

Для поиска генов аминогликозидфосфотрансфераз в полученных сборках метагеномов была написана программа на языке Perl. Основной задачей программы являлся запуск анализа метагеномов с помощью BLASTX и последующий отбор результатов по двум параметрам: гомологии и относительной длине выравнивания. В качестве базы данных для поиска использовали составленный в рамках исследования каталог из 31 аминокислотной последовательности. Отбор результатов выравниваний, полученных с помощью BLASTX, проводили с применением фильтров по гомологии и относительной длине выравнивания. Относительная длина выравнивания вычислялась программой по формуле, где L_{выравнив} — это длина полученного выравнивания, а L_послед — это длина референсной аминокислотной последовательности из каталога. Поскольку в данной работе не ставилась задача поиска новых генов аминогликозидфосфотрансфераз, в качестве минимального значения гомологии выбрали 90 %, а минимального значения относительной длины выравнивания — 80 %. Для определения видового состава исследуемых метагеномов была использована программа MetaPhlAn2 [24].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 

Формирование каталога генов аминогликозидфосфотрансфераз из клинических штаммов

В зависимости от положения гидроксильной группы антибиотика, модифицируемой ферментом, различают 7 подсемейств аминогликозидфосфотрансфераз: Aph(2''), Aph(3'), Aph(3''), Aph(4), Aph(6), Aph(7'') и Aph(9). Каталог генов клинических штаммов был составлен путем обобщения данных, представленных в обзоре [12]. Каталог генов аминогликозидфосфотрансфераз из клинических штаммов приведен в табл. 3.

Поиск генов аминогликозидфосфотрансфераз в российских метагеномах

С помощью созданной программы были проанализированы метагеномы кишечника 11 здоровых людей из России. Результаты анализа представлены в табл. 4. Всего были идентифицированы 3 гена в 7 метагеномах. Все гены были идентифицированы с гомологией 100 %. Самым распространенным оказался ген aph(3')-IIIa, не найденный только в одном метагеноме из семи — D5F. В метагеноме D12F были найдены два гена: aph(2'')-IIa и aph(3')-IIIa. Ген aph(3'')-Ib был идентифицирован только в метагеноме D5F.

Исследуемые метагеномы были проанализированы по видовому составу с помощью программы MetaPhlAn2. Риды, для которых был определен видовой состав, были картированы на метагеномные контиги с помощью Bowtie2. Таким образом, была определена видовая принадлежность контигов, в которых были найдены гены аминогликозидфосфотрансфераз [неопубликованные данные, А. С. Ковтун]. Результаты биоинформатического анализа метагеномов представлены в табл. 5.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Проведенный in silico анализ 11 кишечных метагеномов от здоровых россиян показал  наличие генов аминогликозидфосфотрансфераз только в 7 из них и только 3 генов из 21, найденных в клинических штаммах бактерий Acinetobacter baumannii, Alcaligenes faecalis, Bacillus circulans, Burkholderia pseudomallei, Campylobacter jejuni, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Enterococcus casseliflavus, Enterococcus faecium, Legionella pneumophila и Pseudomonas aeruginosa и включенных в составленный для исследования каталог aph-генов (табл. 3). Речь идет о следующих генах: aph(3'')-Ib, aph(3')-IIIa и aph(2'')-Ia. Наиболее распространенным оказался ген aph(3')-IIIa (CAA24789), найденный в 6 исследуемых метагеномах. Этот ген ранее был выявлен в геноме E. faecalis как определяющий устойчивость к канамицину. Только в одном метагеноме встречался ген aph(3'')-Ib (AAA26442), выявленный ранее в геноме E. coli как определяющий устойчивость к стрептомицину, и ген aph(2'')-Ia (AAA26865), выявленный ранее в геноме E. faecalis как определяющий устойчивость к тобрамицину (табл. 3).

Интересно, что анализ контигов, в которых были выявлены гены аминогликозидфосфотрансфераз, показал их присутствие в геномах бактерий иных видов. Ген aph(3')-IIIa был обнаружен в генетическом окружении, характерном для комменсальной бактерии Ruminococcus obeum, а также условно-патогенных бактерий E. faecium, Roseburia hominis, Streptococcus pyogenes и Staphylococcus epidermidis, но не для E. faecalis. Ген aph(2'')-Ia был обнаружен для Clostridium difficile, а не E. faecalis (табл. 3, табл. 5).  Таким образом, этот ген, оказавшийся наиболее распространенным у энтерококков в исследовании [16], встретился только в одном российском метагеноме и не в энтерококке. Гены aph(2")-Ia и aph(3')-IIIa ранее были обнаружены у метициллин-резистентных штаммов Staphylococcus aureus [17], но в российском метагеноме ген aph(3')-IIIa присутствовал в генетическом окружении, характерном для Staphylococcus epidermidis. Ген aph(3'')-Ib был обнаружен в E. coli.

Представленные результаты согласуются с данными, полученными при сравнительном анализе метагеномов кишечника жителей разных стран мира: возраст, пол и состояние здоровья человека мало влияют на антибиотикорезистентный потенциал микробиоты кишечника, тогда как географическое происхождение человека оказывает существенное влияние на состав резистом [15]. Редкая встречаемость aph-генов в российских метагеномах и их принадлежность к определенным классификационным группам могут указывать на региональную специфичность состава микробиоты и более редкое использование аминогликозидов в лечебных целях у людей, чей микробиом был использован для данного исследования. С другой стороны, у анаэробных бактерий, являющихся большинством в популяции кишечника, отсутствие aph-генов может объясняться тем, что у них нет цитохром-опосредованного транспорта [25]. Важным результатом является наличие в микробиоме здорового человека условно-патогенных бактерий, содержащих aph-гены.

ВЫВОДЫ

В 7 образцах микробиоты 11 здоровых жителей России было установлено наличие генов аминогликозидфосфотрансфераз, ранее выявленных в клинических штаммах бактерий: aph(3'')-Ib, aph(3')-IIIa и aph(2'')-Ia. Наиболее распространенным оказался ген aph(3')-IIIa. Обнаруженные гены встречались у условно-патогенных бактерий Enterococcus faecium, Roseburia hominis, Clostridium difficile, Escherichia coli, Streptococcus pyogenes, Staphylococcus epidermidis. Два из них, E. coli и E. faecium, относятся к 12 самым опасным бактериям (по данным Всемирной организации здравоохранения). В связи с этим при клиническом обследовании пациентов с инфекционными заболеваниями и назначении антибиотиков для их лечения целесообразно проводить диагностический анализ на устойчивость к антибиотикам не только в отношении бактерии-возбудителя, но и в отношении микробиоты пациента.

Исследования распространенности генов устойчивости к антибиотикам в микробиоте желудочно-кишечного тракта российских людей представлены впервые в данной работе. Подобным образом, в том числе с использованием ПЦР-анализа, необходимо проводить поиск и других клинически важных генов устойчивости.