Преждевременные роды (ПР) остаются одним из наиболее актуальных исследовательских направлений в современном акушерстве [1]. Это связано не только с медицинской, но и с социальной значимостью проблемы: ПР обусловливают значительную неонатальную заболеваемость и смертность новорожденных. На долю недоношенных детей приходится 60–70 % случаев ранней неонатальной смертности, до 50 % неврологических заболеваний; мертворождение среди недоношенных детей встречается в 8–13 раз чаще, чем среди доношенных [2, 3].

Несмотря на повышение качества медицинской помощи, частота преждевременных родов не снижается, а в некоторых странах — растет. По данным Всемирной организации здравоохранения, ежегодно 15 миллионов детей рождаются преждевременно, т. е. на сроке до 37 недель беременности [4] Частота ПР в разных странах составляет 5–18 %, в России — 6–15 % в зависимости от региона [5].

Преждевременные роды подразделяются на спонтанные (70–80 % всех случаев ПР) и индуцированные, которые связаны с состоянием здоровья беременной и/или плода [6, 7]. Самопроизвольные роды могут начинаться как с развития регулярной родовой деятельности при целом плодном пузыре (истинные преждевременные роды; на их долю приходится около 40–50 % случае), так и с преждевременного разрыва плодных оболочек при отсутствии регулярной родовой деятельности [8, 9].

По данным литературы, около 40 % случаев ПР обусловлены инфекционными факторами [7, 8, 10]. К ведущему патогенетическому механизму в таких случаях относят развитие неспецифического системного воспалительного ответа (СВО) организма на инфекционные агенты. При синдроме СВО локальное повреждение тканей в зоне инокуляции патогенов вызывает совокупность системных реакций. Этот процесс ассоциирован с дисфункцией врожденного и приобретенного иммунитетов и проявляется нарушением соотношения про- и противовоспалительных цитокинов. В настоящее время очень активно изучается роль цитокинов в развитии преждевременных родов [11]. Так, имеются сведения о том, что повышение уровня провоспалительных цитокинов в содержимом цервикального канала свидетельствует о возможном риске ПР [12]. Данные о состоянии локального иммунного статуса позволяют уточнять молекулярно-биологические аспекты развития различных вариантов ПР.

Целью настоящего исследования явилось изучение особенностей локального иммунного статуса при различных вариантах преждевременных родов.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Нами на базе Дзержинского перинатального центра (Нижегородская область) в 2016–2017 гг. были обследованы 77 рожениц, которых разделили на две группы. Первую (основную) группу составили 52 женщины с диагнозом «спонтанные преждевременные роды» на сроке 22–36 недель беременности, вторую (контрольную) — 25 женщин со своевременными родами. Основная группа была разделена на 2 подгруппы — по вариантам развития ПР. В первую подгруппу (1А) включили 28 беременных с преждевременным разрывом плодных оболочек (ПРПО) при отсутствии регулярной родовой деятельности, во вторую (1Б) — 24 роженицы с развитием регулярной родовой деятельности при целом плодном пузыре. Возраст участниц исследования варьировал от 19 до 41 года и составил в среднем 29,8 ± 5,0 ле. Достоверных различий в группах по этому показателю выявлено не было (p > 0,05).

Общим критерием включения во все группы была одноплодная беременность. Критерии исключения из исследования являлись многоплодная беременность и тяжелые врожденные пороки развития плода.

Анализировали социально-экономическое положение женщин, акушерско-гинекологический и экстрагенитальный анамнез, заболеваемость острыми инфекциями во время беременности, измеряли массу и рост женщин и рассчитывали индекс массы тела.

Для оценки локального иммунного статуса рожениц с началом родов забирали соскоб из цервикального канала стерильным одноразовым зондом. Биоматериал помещали в пластиковые пробирки объемом 1,5 мл, которые содержали 500 мкл среды для стабилизации РН. Для выделения нуклеиновых кислот из материала использовали наборы «Проба НК» («НПО ДНК-Технология», Россия). Далее осуществляли постановку теста «ИммуноКвантэкс» (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия. В данной тест-системе после выделения суммарного пула ДНК и РНК проводится реакция обратной транскрипции для получения матрицы м-РНК, комплементарной ДНК, которая в дальнейшем амплифицируется методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). После этапа амплификации по показателю индикаторного цикла программно рассчитывали уровень экспрессии мРНК генов врожденного иммунитета: IL1B, IL10, IL18, TNFa, TLR4, GATA3, CD68, B2M. На основе интегральной оценки полученных уровней экспрессии генов делали заключение о наличии или отсутствии локальной воспалительной реакции по величине индекса воспаления (ИВ). Значение ИВ более 60 % оценивали как воспаление, менее 50 % — как отсутствие воспалительной реакции, диапазон значения 50–60 % — как «нельзя исключить» (серая зона).

Анализ полученных данных проводили при помощи программ Microsoft Excel 2010 (надстройка AtteStat) и Statistica v10 (StatSoft, США). Количественные данные (уровни экспрессии генов) представляли в виде медианы (Ме) и межквартильного интервала (нижний (0,25) и верхний (0,75) квартили). Для определения достоверности различий между исследуемыми группами рассчитывали критерий Манна–Уитни. Для оценки качественных признаков применяли хи-квадрат Пирсона с поправкой Йейтса, при частотах меньше 5 — двусторонний точный критерий Фишера (p). Для оценки связи изучаемых факторов с развитием преждевременных родов рассчитывали величину отношения шансов (ОШ) с доверительным интервалом 95 %. Для всех видов анализа статистически достоверными считались значения p ˂ 0,05.

Проведение исследования было одобрено этическим комитетом Нижегородской государственной медицинской академии (протокол № 12 от 05.10.2015). Все участницы дали письменное информированное согласие на участие в исследовании.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

При анализе социально-экономического положения пациенток выяснили, что в основной группе (с ПР) достоверно больше пациенток со средним образованием — 65,4 % (χ² = 6,3; p = 0,012) — и одиноких женщин — 17,3 % (p = 0,02).

При оценке массо-ростовых показателей обнаружили, что более высоким значением индекса массы тела (ИМТ) обладали пациентки основной группы, где среднее значение показателя составило 25,4 ± 5,2 кг/м², в то время как в контрольной группе —22,5 ± 2,3 кг/м² (p = 0,009). Статистически значимых отличий по росту среди беременных разных групп не отметили (p > 0,05).

Изучение особенностей акушерско-гинекологического анамнеза показало, что только в основной группе встречались пациентки с ПР в анамнезе (15,4 %, p = 0,048; ОШ = 9,7 [0,5–175,9]). Также в данной группе достоверно чаще, чем в контрольной, присутствовали женщины с двумя и более лечебно-диагностическими выскабливаниями полости матки в анамнезе (34,6 %, p = 0,013; ОШ = 6,1 [1,3–28,8]).

Нами были выявлены отличительные особенности акушерско-гинекологического анамнеза среди беременных с различными вариантами преждевременных родов. Так, в подгруппе с истинными ПР (подгруппа 1Б) статистически чащ встречались первобеременные женщины — 45,8 % (p = 0,038). Пациентки подгруппы 1Б также достоверно раньше начинали жить половой жизнью, при этом средний возраст начала половой жизни составил 15,6 ± 1,3 года (p = 0,009). Кроме того, в этой подгруппе 37,5 % женщин отмечали наличие воспалительных заболеваний органов малого таза до беременности. Это достоверно больше, чем в подгруппе 1А (p = 0,045).

Анализ экстрагенитальной патологии исследуемых пациенток показал, что в основной группе было больше беременных с хронической никотиновой зависимостью (34,6 %, p = 0,013; ОШ = 6,0 [1,29–28,8]) и хроническими специфическими инфекциями (хронический гепатит С, хронический гепатит В, ВИЧ-инфекция): 13,5 %, p = 0,047; ОШ = 8,4 [0,5–153,3].

Наиболее частым осложнением беременности в основной группе в нашем исследовании оказалась угроза прерывания беременности, которая отмечалась у 44,2 % пациенток. В то же время частота встречаемости этой патологии в контрольной группе составила 12 %, что достоверно меньше, чем в основной группе (p = 0,017; ОШ = 4,9 [1,3–18,7]). Формирование истмико-цервикальной недостаточности во втором триместре у пациенток с ПР было выявлено в 19,2 % случаев, в контрольной группе беременных с ИЦН отмечено не было (p = 0,025; ОШ = 12,6 [0,7–224,3]).

Пациентки основной группы достоверно чащболели острыми инфекционными заболеваниями (ОРВИ, инфекция мочеполовых путей, обострение пиелонефрита) во время беременности: 36,5 %, p = 0,032; ОШ = 4,2 [1,1–16,0]. Обращает на себя внимание тот факт, что у беременных с ПРПО (подгруппа 1А) чаще диагностировалась острая инфекция по сравнению с женщинами с истинными преждевременными родами (подгруппа 1Б) (46,4 %, p = 0,044). Только в группе с преждевременными родами были зарегистрированы признаки хронической плацентарной недостаточности, включая синдром задержки роста плода: 13,5 % случаев, ОШ 8,4 [0,5–153,3]. При этом следует отметить, что достоверно чаще данное осложнение беременности встречалось в подгруппе 1Б (25 %, p = 0,04).

Наиболее интересные данные были получены нами при изучении профиля экспрессии генов IL1B, IL10, IL18, TNFa, TLR4, GATA3, CD68 и B2M в клетках соскобов из цервикального канала. При использовании тест-системы «ИммуноКвантэкс» мы обнаружили, что определение отдельных показателей локального иммунного ответа не имеет прогностической ценности в отношении преждевременных родов. Так, оказалось, что не было достоверных различий между уровнями экспрессии генов IL1B, TNFa, CD68 и B2M ни по группам исследуемых, ни внутри основной группы, т. е. по подгруппам (p > 0,05). В то же время у пациенток с ПРПО без развития регулярной родовой деятельности (подгруппа 1А) значение экспрессии TLR4 было достоверно ниже, чем у женщин c истинными преждевременными родами (подгруппа 1Б) (p = 0,037). В контрольной группе уровень экспрессии TLR4 оказался самым высоким среди всех групп, а также статистически значимо отличался от значения показателя в подгруппе 1А (p = 0,021) и не отличался от значения показателя в подгруппе 1Б (p = 0,408).

Достоверное различие было выявлено нами по уровню экспрессии транскрипционного фактора GATA3. Его минимальное значение отмечалось в подгруппе 1А, а максимальное — в подгруппе 1Б (p = 0,012). При этом между значением показателя в подгруппе 1Б и контрольной значимого различия не было (p > 0,05).

Также были отмечены достоверные различия в уровнях экспрессии генов IL10 и IL18 между подгруппами: в подгруппе 1А значения данных показателей были достоверно ниже в сравнении с подгруппой 1Б (p = 0,021 и p = 0,025 соответственно).

Таким образом, увеличение или уменьшение экспрессии отдельных генов белков, обладающих про- и противовоспалительным действием, не дают полного представления об изменениях в состоянии мукозального иммунитета. В то же время интегральная оценка соотношений уровней экспрессии исследуемых генов и рассчитанный на ее основе индекс воспаления позволяет сделать заключение о наличии или отсутствии воспалительной реакции. Полученные нами значения ИВ (таблица) имели принципиальные различия как между основной и контрольной группами, так и внутри основной группы. Самым высоким ИВ обладали пациентки подгруппы 1А (с ПРПО) — 99,5 %, в то время как в подгруппе 1Б данный показатель составил 27,2 % (p < 0,01), а в группе контроля — 13,1 % (p < 0,01). Значения ИВ в подгруппе 1Б и группе контроля оказались сопоставимы (p > 0,05).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В настоящее время поиску причин преждевременных родов и определению возможности их прогнозирования посвящено много работ [1, 7, 11, 13]. Однако, несмотря на очевидный прогресс в исследованиях, многие вопросы остаются не до конца выясненными. К факторам риска развития ПР большинство исследователей относят: медицинские аборты в анамнезе, индуцированную беременность, поздние выкидыши, конизацию шейки матки, цервико-вагинальную инфекцию, инфекцию мочевыделительной системы, тяжелую экстрагенитальную патологию, никотиновую зависимость, низкий уровень жизни, стрессы [14]. Наше исследование подтвердило данные мировой литературы. Мы наблюдали высокий индекс массы тела у значительного числа женщин с ПР в сравнении с контрольной группой (p = 0,009). Факторами риска ПР в нашем исследовании явились: указания на преждевременные роды в анамнезе, два и более внутриматочных вмешательства, курение, нарушение жирового обмена, инфекции острые и хронические.

В последние годы развитие ПР связывают с нарушением баланса про- и противовоспалительных молекул в организме женщины. При ПР с преждевременным разрывом плодных оболочек индекс воспаления с большей вероятностью (p < 0,01) будет высоким. По данным отечественных и зарубежных авторов, наиболее распространенным патогенетическим механизмом развития ПРПО является инфицирование нижнего полюса плодного пузыря [9, 15]. При попадании патогенов в организм срабатывает первая линия иммунологической защиты, представленная элементами врожденного иммунитета. Первичный воспалительный ответ на патогены опосредован специфическими Toll-подобными рецепторами (TLRs), активация которых происходит при взаимодействии с клеточной стенкой микроорганизмов. Результатом этого взаимодействия является увеличение синтеза провоспалительных цитокинов, хемокинов и простагландинов. Известно, что увеличение синтеза цитокинов в шейке матки является причиной лейкоцитарной инфильтрации и открытия шейки матки. Увеличивающаяся при этом активность протеаз может приводить к дестабилизации плодных оболочек и их преждевременному разрыву [16]. Участие TLRs в развитии преждевременных родов подтверждено многими исследованиями [17]. Так, Тютюнник и соавт. [13] показали достоверное снижение экспрессии гена TLR4 в группе женщин с преждевременными родами, однако эта закономерность выявлена при наличии дисбиотических нарушений микрофлоры влагалища у данных пациенток.

По данным других авторов [18, 19], при преждевременных родах наблюдается увеличение экспрессии гена TLR4 и TLR2 непосредственно перед родами как в слизистой оболочке цервикального канала, так и в плацентарной ткани. Повышенная экспрессия генов TLRs приводит к выбросу провоспалительных цитокинов, которые попадают в кровоток, в том числе и кровоток плода, и способствуют преждевременной активации кортикотропин-рилизинг гормона и плацентарно-надпочечникового эндокринного каскада. Результат — повышение тонуса матки и возможность развития ПР.

В нашем исследовании мы не обнаружили достоверных различий между основной и контрольной группами по уровням экспрессии большинства генов врожденного иммунитета (p > 0,05). Как известно, в норме при развитии физиологической беременности цитокины регулируют наступление родовой деятельности. Началу родов предшествует инфильтрация плаценты и окружающих материнских тканей различными цитокинами даже при отсутствии инфекции. Результатом этой активации является синтез провоспалительных цитокинов IL-1, IL-6, IL-8, TNF и простагландинов, стимулирующих сокращение матки [20].

В нашей работе было установлено, что достоверной разницы между основной и контрольной группами по уровню экспрессии гена TLR4 нет (p > 0,05), что связано, по-видимому, с большой разнородностью синдрома ПР. Однако изучение экспрессии генов TLR4 и GATA3 по подгруппам показало различия в их содержании при разных вариантах развития ПР. Так, у пациенток подгруппы 1А экспрессия TLR4 была достоверно снижена (p = 0,037) в сравнении с пациентками подгруппы 1Б (истинные ПР) и пациентками контрольной группы (p = 0,021). В то же время различия в уровне экспрессии TLR4 между подгруппой 1Б и группой контроля были недостоверны (p > 0,05). Похожая тенденция наблюдалась в отношении экспрессии гена GATA3, где минимальные значения показателя были отмечены у женщин в подгруппе 1А (p < 0,05 при сравнении с результатами в подгруппе 1Б). Различия в сравнении с контролем были недостоверными (p > 0,05).

В доступной нам литературе нет упоминаний о значимости индекса воспаления в развитии ПР. В нашем исследовании ИВ составил 99,5 % у женщин с ПРПО (подгруппа 1А), что достоверно выше (p < 0,01) значения показателя в подгруппе 1Б — 27,2 %.

По всей видимости, соотношение уровней экспрессии генов TLR4/GATA3 и индекс воспаления могут быть своеобразными маркерами начала преждевременных родов. Если провоспалительные молекулы численно преобладают над противоспалительными, запускается каскад реакций, приводящий к развитию синдрома системного воспалительного ответа и, как следствие, к преждевременному разрыву плодных оболочек. В случае истинных преждевременных родов, по-видимому, задействуются другие механизмы активации системы «мать–плацента–плод», и их изучение продолжается.

ВЫВОДЫ

Исследование с тестом «ИммуноКвантэкс» у пациенток со спонтанными преждевременными родами позволяет определить состояние локального иммунного статуса и вариант развития ПР. При этом имеет значение определение не отдельных факторов мукозального иммунитета, обладающих про- и противовоспалительными свойствами, а именно их соотношения и расчет индекс воспаления.

Нами были выявлены особенности в состоянии локального иммунного статуса для различных вариантов преждевременных родов. Так, у рожениц с ПР и преждевременным разрывом плодных оболочек в иммунном ответе преобладает реакция воспаления со снижением уровня экспрессии генов TLR4 и GATA3. У этих пациенток индекс воспаления выше, чем у женщин с истинными ПР и своевременными родами. Таким образом, местная воспалительная реакция является причиной преждевременных родов по типу ПРПО, причем в этом случае снижается значение противовоспалительных факторов, а не растет значение провоспалительных факторов. Что касается варианта истинных преждевременных родов, то нами не были обнаружены достоверные отличия в состоянии локального иммунного статуса у таких пациенток и своевременно родивших женщин, что указывает на единый патогенетический механизм реализации родового акта.

Дальнейшего изучения требует возможность использования тест-системы «ИммуноКвантэкс» в качестве прогностического инструмента для оценки вероятности реализации спонтанных ПР у беременных с угрожающими ПР. Данные о наличии местной воспалительной реакции у пациенток из групп высокого риска по развитию ПР могут позволить своевременно провести комплекс профилактических мероприятий, направленных на пролонгирование беременности.