ISSN Print 2070–7320
ISSN Online 2070–7339
НАУЧНЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ ЖУРНАЛ РНИМУ ИМЕНИ Н. И. ПИРОГОВА
МЕТОД
Модификация мультиплексной ПЦР в «реальном времени» для количественной оценки фракций внеклеточной ДНК разного размера
Информация об авторах
1 ООО «Биокод», Москва
2 Лаборатория палеогеномики, факультет естественных наук,Новосибирский государственный университет, Новосибирск
3 Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н. Н. Блохина, Москва
Для корреспонденции: Соколова Екатерина Алексеевна
Новомещеренский проезд, д. 9, стр. 1, г. Москва, 119619; ur.xednay@8062aeavolokos
Информация о статье
Вклад авторов в работу: Е. А. Соколова — планирование исследования, анализ данных, подготовка черновика рукописи; И. В. Хлистун — проведение экспериментальных работ, подготовка черновика рукописи; Д. Н. Кушлинский — сбор биологического материала, клиническая характеристика пациентов, подготовка черновика рукописи.
Статья получена: 25.08.2017
Статья принята к печати: 30.08.2017
Опубликовано online: 29.10.2017
|
Количественный анализ циркулирующей внеклеточной ДНК (вкДНК) для оценки терапевтической эффективности новых антиметастатических препаратов в ксенотрансплантатах был предложен в 1998 г. [1]. Он был основан на ПЦР-амплификации последовательностей Alu генома человека с использованием 32P-меченного 2'-дезоксицитидин-5'-трифосфата (dCTP) и обладал высокой чувствительностью (обнаружение эквивалента одной опухолевой клетки человека в 1 × 106 мышиных клеткок), достигаемой за счет высокого содержания последовательностей Alu в геномной ДНК человека. Alu-повторы представляют собой характерные для приматов повторяющиеся элементы ДНК, рассеянные по геному в количестве от 500 тыс. до 1 млн копий. Ввиду высокой копийности и относительной консервативности они представляют собой отличную мишень для амплификации малых количеств ДНК человека [2]. В 2002 г. с целью адаптации к рутинному применению метод был модифицирован: было предложено применять полимеразную цепную реакцию (ПЦР) в «реальном времени» с детекцией сигнала с помощью интеркалирующего красителя [3, 4]. Достоинства метода навели исследователей на мысль разработать аналогичную систему для семейства повторов hLINE-1, длина консенсусной последовательности которого около 6 тпн, а частота — примерно 200 тыс. копий на геном человека [5]. В 2007 г. была опубликована работа, описывающая подход к оценке количества вкДНК с помощью ПЦР в «реальном времени» для hLINE-1 [6].
Количественный анализ циркулирующей вкДНК ранее рассматривался как потенциальный метод выявления рака яичников у женщин. Несмотря на наличие отдельных публикаций с обнадеживающими результатами, в целом для метода характерны не очень высокие значения по ряду важных диагностических параметров [7]. Соотношение длинных (более 180 п. н.) и коротких фрагментов вкДНК может являться более перспективным маркером опухоли. Предполагается, что продуктом некроза клеток опухоли могут быть более длинные фрагменты ДНК, что изменяет соотношение различных форм вкДНК [8].
С помощью количественной ПЦР с различными размерами ампликона несколько исследователей показали, что более длинные фрагменты ДНК составляют значительную долю от общего количества вкДНК у больных раком [9, 10]. Эта доля уменьшалась на фоне лечения, а ее сохранение было связано с плохим прогнозом [9]. В то же время в других исследованиях при анализе одновременно длины ампликона и специфичных для опухолевой ДНК соматических мутаций было показано, что опухолевая вкДНК, напротив, короче [11]. Можно также предположить, что степень фрагментированности опухолевой вкДНК может зависеть от типа рака и преобладания какого-либо типа клеточной гибели.
В настоящей работе мы описываем метод мультиплексной количественной ПЦР, разработанный, валидированный и примененный нами для исследования степени фрагментированности опухолевой вкДНК при карциноме яичников.
ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ
В исследовании приняли участие пациентки Национального медицинского исследовательского центра онкологии им. Н. Н. Блохина. Критерий включения в исследование — серозная аденокарцинома яичников стадий III–IV. Группу пациенток с раком яичников составили 14 женщин со средним возрастом 64,3 ± 5,6 года (медиана — 64 года), а контрольную — 16 условно здоровых женщин без онкологических заболеваний со средним возрастом 60,8 ± 8,2 года (медиана — 60,5 года). Исследование было одобрено локальным этическим комитетом НМИЦ онкологии им. Н. Н. Блохина (протокол № 3 от 16.05.2016). Данные об участниках исследования были деперсонифицированы.
В качестве биологического материала для исследования использовали плазму крови. Образцы крови условно здоровых женщин были получены при проведении плановых биохимических анализов. Кровь отбирали в количестве 6 мл в вакутейнеры с ЭДТА. Затем пробы центрифугировали при 2 000 g в течение 10 мин, плазму переносили в новые пробирки и повторно центрифугировали при 2 000 g в течение 10 мин. Аликвоты плазмы после центрифугирования вновь переносили в новые пробирки и хранили при –70 °С. Аликвоты размораживали непосредственно перед выделением ДНК. Выделение ДНК проводили с помощью набора QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (Qiagen, Нидерланды).
Дизайн праймеров и флуоресцентных зондов для Alu и hLINE-1
Для выбора олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентного зонда для Alu нами было проведено выравнивание консенсусных последовательностей наиболее распространенных семейств Alu-повторов: Alu Sx, Alu Sp и Alu Y [12] (рис. 1).
Для hLINE-1 последовательности праймеров были заимствованы из статьи [6]. Флуоресцентный зонд разрабатывали самостоятельно с помощью программы UGENE software v1.14 [13] и OligoAnalyzer software v1.0.3 (Teemu Kuulasmaa, Финляндия). Для возможности мультиплексирования ПЦР для Alu и hLINE-1 флуоресцентные зонды содержали разные красители. Структура праймеров и флуоресцентных зондов для Alu и hLINE-1, а также длины амплификационных продуктов приведены в табл. 1.
Опредение вкДНК в плазме крови методом ПЦР в «реальном времени»
ПЦР в «реальном времени» была проведена на приборе CFX96 Thermal Cycler (Bio-Rad, США). Объем амплификационной смеси составлял 25 мкл и содержал 65 мМ Tris-HCl (pH 8,9), 24 мМ сульфата аммония, 3,5 мМ хлорида магния, 0,05 % Tween-20, 0,2 мМ dNTP, 0,3 мМ каждого праймера, 0,1 мМ каждого флуоресцентного зонда (табл. 1) и 1 ед. акт. термостабильной модифицированной Taq-полимеразы («Интерлабсервис», Россия). ПЦР проводили по протоклу: денатурация — 15 мин при 96 °C с последующими 45 циклами по 10 с при 96 °C и 30 с при 58 °C. Оптимальную температуру отжига подбирали эмпирически.
Динамический диапазон измерений, нижий порог детекции мультиплексной ПЦР
Первоначальную концентрацию раствора двухнитевой ДНК проверяли спектрофотометрически на длине волны 260 нм (NanoDrop LITE, Thermo Fisher Scientific, США). Отношение поглощения на длинах волн 260 и 280 нм (A260/280) использовали для оценки чистоты препарата. Динамический диапазон измерений и нижний порог детекции мультиплексной ПЦР оценивали с помощью 7 последовательных 10-кратных разведений геномной ДНК человека известной концентрации (80 нг/мкл). Измерение каждого образца проводили в 3 повторностях. Нижний порог детекции использовали для демонстрации чувствительности детекции разработанного метода и определяли его как количество ДНК человека на 1 мкл образца.
Статистическая обработка данных
Оценку эффективности мультиплексной ПЦР (E) и динамического диапазона линейности (R2) проводили с помощью программного обеспечения, поставляемого с прибором CFX96 Thermal Cycler — Bio-Rad CFX Manager Software v3.1. Статистическую значимость различий между соотношениями фракций (R) в экспериментальной и контрольной группах оценивали с помощью непараметрического критерия Манна–Уитни.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Оптимизация условий мультиплексной ПЦР
Оптимизацию условий мультиплексной ПЦР проводили путем подбора оптимальной температуры отжига в диапазоне 55–68 °C. Наилучшее соотношение уровней флуроресценции и максимальная эффективность мультиплексной ПЦР была при температуре отжига 58 °C.
Динамический диапазон измерений, нижий порог детекции мультиплексной ПЦР
Мы провели эксперимент с использованием 7 последовательных 10-кратных разведений геномной ДНК человека в концентрации 80 нг/мкл, в результате были получены калибровочные кривые (рис. 2). Аликвота каждого разведения была оценена в 3 повторностях. Динамический диапазон линейности мультиплексной ПЦР составил 6 порядков (рис. 3). Эффективность ПЦР для фрагмента Alu составила 94,6 % (линейность R2 = 0,988), для фрагмента hLINE-1 — 92,1 % (линейность R2 = 0,996).
Нижний порог детекции был определен также с использованием 7 последовательных 10-кратных разведений геномной ДНК человека в концентрации 80 нг/мкл, каждая аликвота — в 3 повторностях (в нг/мкл: A1 = 80, А2 = 8, А3 = 0,8, А4 = 0,08, А5 = 0,008, А6 = 0,0008, А7 = 0,00008, А8 = 0,000008) и при наличии отрицательного контроля реакции. Для обоих компонентов мультиплексной ПЦР (Alu и hLINE-1) нижний порог детекции составил 0,08 пг/мкл.
Анализ вкДНК в плазме крови женщин с раком яичников и здоровых женщин
Разработанный метод для количественного определения последовательностей Alu и hLINE-1 генома человека был применен для оценки соотношения фракций вкДНК в плазме крови женщин с раком яичников (n = 14) и условно здоровых женщин без онкологических заболеваний (n = 16). Значение соотношения фракций (R) рассчитывали, деля количество фрагмента Alu (размером 235 п. н.) в условных единицах на количество фрагмента hLINE-1 (размером 82 п. н.) также в условных единицах. Нами не были выявлены достоверные различия по R между группами (табл. 2, рис. 4).
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Наше исследование показало, что разработанный метод мультиплексной ПЦР в «реальном времени» на основе Alu и hLINE-1 является надежным, точным и чувствительным методом количественного определения плазменной вкДНК по следующим причинам. Во-первых, по сравнению с уже существующими методами детекции вкДНК на основе Alu и hLINE-1 он предполагает использование флуоресцентных зондов. Это гарантирует специфичность детекции продуктов ПЦР в отличие от их детекции с помощью интеркалирующего красителя [3, 4, 14]. Во-вторых, использование флуоресцентных зондов дает возможность мультплексирования ПЦР, что сокращает количество манипуляций и продолжительность анализа. В-третьих, метод имеет адекватные аналитические характеристики: динамический диапазон измерений — 6 порядков, эффективность ПЦР — более 90 %. В-четвертых, нижний порог детекции составил 0,08 пг/мкл образца, что на 4–5 порядков ниже концентрации вкДНК, обычно выделяемой из плазмы крови здоровых пациентов, например при выделении вкДНК с помощью коммерческого набора QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit из 1 мл плазмы с последющей элюцией ДНК в конечный объем 50 мкл концентрация образцов — 0,5–1,5 нг/мкл [15]. И, наконец, использование ампликонов различной длины в мультиплексной ПЦР позволяет оценить степень фрагментированности опухолевой вкДНК.
Мы применили разработанный метод на небольшой выборке пациенток с раком яичников (n = 14). Сравнение значений соотношения фракций вкДНК (R) между группой женщин с онкологическим заболеванием и контрольной группой условно здоровых женщин не выявило сатистически значимых различий (p = 0,34). Тем не менее пока рано говорить о действительном отсутствии различий — и ввиду малой выборки, и ввиду довольно грубой оценки распределения фракций сиспользованием всего двух референтных длин — 235 и 82 п. н. Дальнейшие исследования, в том числе включающие электрофоретическую селекцию фрагментов вкДНК по фракциям, с применением количественной ПЦР должны способствовать появлению более рационального дизайна диагностических систем для выявления соматических мутаций в опухолевой вкДНК.
ВЫВОДЫ
Нами разработан и валидирован метод мультиплексной ПЦР для количественной оценки разных по размеру фракций внеклеточной ДНК с хорошими аналитическими характеристиками: динамический диапазон измерений — 6 порядков, эффективность ПЦР — более 90 %. С использованием разработанного метода показали, что индексы фрагментированности вкДНК в группе женщин с раком яичников и в группе условно здоровых женщин без онкопатологий достоверно не различаются. Необходимы дальнейшие исследования на более значительных выборках и с применением электрофореза для разделения фракций вкДНК.