ОРИГИНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

Оценка представленности внеклеточных РНК изоформ VEGF в плазме крови пациенток с раком молочной железы

Информация об авторах

1 Лаборатория редактирования генома,
Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В. И. Кулакова, Москва

2 Патологоанатомическое отделение,
Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В. И. Кулакова, Москва

3 Отделение патологии молочной железы,
Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В. И. Кулакова, Москва

Для корреспонденции: Денис Владимирович Ребриков
ул. Академика Опарина, д. 4, г. Москва, 117997; moc.liamg@vokirberd

Информация о статье

Благодарности: авторы благодарят Ольгу Бурменскую из отдела клинической и молекулярной генетики Национального медицинского исследовательского центра акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В. И. Кулакова за обсуждение результатов исследования.

Вклад всех авторов в работу равнозначен: подбор и анализ литературы, планирование исследования, сбор, анализ и интерпретация данных, подготовка черновика рукописи, внесение исправлений.

Статья получена: 15.08.2017 Статья принята к печати: 25.08.2017 Опубликовано online: 30.10.2017
|

Циркулирующие в плазме крови молекулы нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) давно позиционируют в качестве диагностических и прогностических маркеров различных патологических процессов в организме человека [1, 2, 3, 4]. Однако информативный потенциал этого легкодоступного для анализа биологического материала далеко не исчерпан. Постоянный и мощный «мониторинг» кровеносной системой практически всех органов и тканей позволяет обнаружить отклонения от нормального состава циркуляции при патологических изменениях в любой части организма. И в то время как количественный состав ДНК в клетках разных тканей довольно стабилен, профиль транскриптов уникален для каждого типа клеток, что можно использовать при разработке диагностического инструментария.

Появление внеклеточных молекул РНК (вкРНК) в кровотоке имеет различную природу (некроз, апоптоз, активная секреция [5, 6, 7, 8]). Количественная оценка уровня отдельных транскриптов в плазме методом ПЦР представляет собой рутинный и сравнительно недорогой диагностический метод, который в случае обнаружения новых информативных маркеров легко внедрить в медицинскую практику в качестве скринингового подхода.

Рак молочной железы (РМЖ) является самым распространенным онкологическим заболеванием у женщин — на него приходится 16 % всех случаев заболевания раком [9]. В литературе представлены обширные данные, демонcтрирующие изменение концентрации вкРНК при онкогенезе [1, 2]. В процессы опухолеобразования, как правило, вовлечены гены цитокинов, а также факторов клеточного роста и дифференцировки. Цитокины играют важную роль как в регуляции индукции опухолеобразования, так и в защите от прогрессии РМЖ [10, 11].

Фактор роста эндотелия сосудов (vascular endothelial growth factor, VEGF) является одним из ключевых белков, воздействующих на процессы формирования сосудов, что, в свою очередь, напрямую влияет на рост опухоли. Ангиогенез необходим опухоли для обеспечения клеток кислородом при увеличении размеров новообразования, а также для гематогенного метастазирования. Цитокины и факторы роста, секретируемые опухолевыми и стромальными клетками, стимулируют пролиферацию эндотелиальных клеток. Фактор роста эндотелия сосудов тесно связан с повышенной агрессивностью и метастазированием опухоли [12, 13, 14]. VEGF повышен в сыворотке крови у пациентов с онкологическими заболеваниями, и есть данные, что измерение циркулирующего VEGF является суррогатным маркером ангиогенеза и/или метастазирования [15]. Аномальный ангиогенез — общая черта многих форм рака, причем различные изоформы VEGF играют разную роль в этих процессах. Показано, что VEGF-121 является самой опухолегенной изоформой в экспериментальных моделях рака молочной железы [16]. Экспрессия VEGF-121 возрастает в сравнении с VEGF-165 при злокачественных новообразованиях толстой кишки и предстательной железы [17, 18].

Ранее нами было показано, что на начальных стадиях РМЖ достоверно повышен уровень вкРНК IL-8 и IL-18, а уровень IL-6 не изменяется [19]. Целью настоящего исследования было оценить уровень вкРНК трех наиболее представленных изоформ VEGF: VEGF-121, VEGF-165 и VEGF-189 — на ранних стадиях РМЖ и подтвердить ранее полученные данные для IL-6, IL-8 и IL-18.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Исследуемую группу составили 36 женщин с гистологически подтвержденным диагнозом «рак молочной железы». Возраст пациенток варьировал от 34 лет до 81 года, средний возраст составил 57,9 года. Опухоль была диагностирована в 0 стадии (TisN0M0) у 2 пациенток, в I стадии (T1N0M0) — у 17 женщин, в стадии IIA — у 13 (T1N1M0 — 7 больных и T2N0M0 — 6), в стадии IIB (T2N1M0) — у 2, в стадии IIIA (T2N2M0) — у одной и в стадии IIIC (T2N3M0) — у одной пациентки. Опухоль менее 2 см выявлена у 32 пациенток. Метастазы в регионарные лимфоузлы были обнаружены у 11 пациенток, из них метастазы в 1–3 лимфоузлах обнаружены у 9 пациенток, в 4 лимфоузлах и более — у 2 женщин. Наиболее часто регистрировался неспецифический протоковый гистологический вариант (21 случай), дольковый вариант был диагностирован у 4 пациенток, особые формы рака — у 9, внутрипротоковый рак — у 2 больных. По степени злокачественности все случаи разделились следующим образом: I степень злокачественности — 6 случаев, II степень — 16, III — 14 случаев. Никто из пациентов, включенных в исследование, не получал предоперационную противоопухолевую терапию.

Контрольную группу составили 56 клинически здоровых женщин (возраст варьировал от 24 до 55 лет, средний возраст — 40 лет).

Информация о всех женщинах, принимавших участие в исследовании, была деперсонифицирована. Исследование одобрено локальным этическим комитетом (протокол № 2016/67).

У пациенток с РМЖ кровь забирали до начала операции. Образцы крови у обследуемых обеих групп забирали в одноразовые пробирки BD Vacutainer (Becton, Dickinson and Company, США) с ЭДТА и доставляли в лабораторию при комнатной температуре в течение 30 мин. Для получения плазмы 1 мл крови отбирали в полипропиленовую пробирку на 1,5 мл и центрифугировали при 1000 об/мин 10 мин, после чего надосадочную жидкость переносили в новую пробирку и центрифугировали при 3000 об/мин 10 мин. После центрифугирования верхнюю фракцию (плазму) переносили в новые пробирки и хранили при −70 °С не более 10 дней. Экстракцию вкРНК проводили набором «ПРОБА-НК» («ДНК-Технология», Россия) согласно инструкции производителя. Очищенную вкРНК немедленно использовали для постановки обратной транскрипции со специфичными ОТ-праймерами по стандартному протоколу. Полученную комплементарную ДНК либо сразу использовали для постановки ПЦР, либо хранили при −20 °С не более 10 дней.

Внеклеточную РНК определяли методом количественной ОТ-ПЦР с использованием коммерческой тест-системы «ИммуноГенетика» («ДНК-Технология», Россия). Реакцию проводили в детектирующем амплификаторе DTprime («ДНК-Технология», Россия) по предлагаемому производителем тест-системы протоколу.

В качестве нормировочного использовали транскрипт β-глюкуронидазы (GUSB), не меняющий представленность в ходе опухолеобразования [20, 21]. Нормировочные значения для транскриптов каждого гена рассчитывали с помощью метода ∆∆Ct [22]. Для оценки статистической значимости полученных различий был использован метод параметрической статистики (критерий Стьюдента). Различие групп полагали достоверным при p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

На рисунке приведены данные об уровне представленности исследуемых генов (IL-6, IL-8, IL-18, VEGF-121, VEGF- 165, VEGF-189) и нормировочного гена GUSB в плазме крови больных РМЖ и контрольной группы.

Достоверные различия в уровне представленности вкРНК в группе больных РМЖ и контрольной группе обнаружены для транскриптов IL-8, IL-18, VEGF-121 и VEGF-165 (p < 0,05). Транскрипты IL-6 и VEGF-189 хоть и показали несколько большую представленность в группе пациенток с РМЖ, не достигли значимого уровня.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Полученные результаты согласуются с данными работы [19], где относительные количества РНК IL-8 и IL-18 были достоверно повышены у пациенток на ранних стадиях РМЖ в сравнении со здоровыми испытуемыми.

Достоверное повышение у пациенток с РМЖ в составе циркуляции вкРНК изоформ VEGF-121 и VEGF-165 также согласуется с данными об экспрессии этих вариантов в ходе опухолеобразования [12, 13, 14, 15, 16, 17, 18]. Tokunaga и соавт. классифицировали паттерны мРНК VEGF различных опухолей человека на три типа: 1 — экспрессирующий только VEGF-121; 2 — VEGF-121 и VEGF-165; 3 — VEGF-121, VEGF-165 и VEGF-189 [23]. Сочетание всех трех изоформ (третий тип) обнаруживается в метастазах рака прямой кишки [23], при карциноме почек [24], гепатоцеллюлярной карциноме [25] и раке легких с плохим прогнозом [26]. По мнению ряда авторов, VEGF-189 индуцирует петлю аутокринной пролиферации при РМЖ через рецепторы семейства семафоринов (в частности, через Neuropilin-1) [27]. Наши данные для РМЖ в целом подтверждают гипотезу Tokunaga, демонстрируя присутствие в составе циркуляции РНК либо только VEGF-121, либо VEGF-121 в сочетании с VEGF-165 и/или VEGF-189.

ВЫВОДЫ

Полученные результаты подтверждают ранее опубликованные данные о повышенном уровне представленности в составе циркуляции транскриптов IL-8 и IL-18 у пациенток с раком молочной железы I и II стадий. У больных РМЖ также обнаружено повышенное содержание вкРНК VEGF-121 и VEGF-165. Для внеклеточной фракции РНК плазмы крови при РМЖ I и II стадий подтверждается гипотеза Tokunaga о базовых изоформах роста опухоли VEGF-121 и VEGF-165, а также изоформе VEGF-189 как факторе метастазирования.

КОММЕНТАРИИ (0)