ISSN Print 2070–7320
ISSN Online 2070–7339
НАУЧНЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ ЖУРНАЛ РНИМУ ИМЕНИ Н. И. ПИРОГОВА
ОРИГИНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ
Адаптивный иммунитет и генетические аспекты прогрессирования туберкулезной инфекции у детей
Информация об авторах
Кафедра педиатрии ДПО, Центр повышения квалификации и профессиональной переподготовки специалистов,Омский государственный медицинский университет, Омск
Для корреспонденции: Плеханова Мария Александровна
ул. Ленина, д. 12, г. Омск, 644099; ur.liam@sulp-anid
Информация о статье
Финансирование: работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований, проект № 16-16-55001.
Статья получена: 24.09.2017
Статья принята к печати: 25.10.2017
Опубликовано online: 13.01.2018
|
Исследования последних лет установили важность клеточного иммунитета и интерферона гамма (ИФН-γ) для защиты организма человека от микобактерий туберкулеза (МБТ), но механизмы формирования иммунологической компетентности в отношении туберкулеза (ТБ) остаются малоизученными [1]. Известно, что пролиферации лимфоцитов, ответственных за продукцию ИФН-γ, способствуют белки, секретируемые МБТ на ранней стадии инфекции [2]. В ряде исследований было установлено, что у больных ТБ с нерезистентными генотипами по гену ИФН-γ (IFNG) уровень синтеза этого цитокина различен и коррелирует со степенью тяжести заболевания [3, 4].
Также ведется поиск генов-кандидатов при ТБ, вызывающих нарушения врожденного и адаптивного иммунитета [1, 5, 6, 7, 8, 9]. Ранее большое внимание уделялось роли полиморфизма гена IFNG в развитии различных заболеваний, в том числе туберкулеза [3, 10, 11, 12, 13].
Изучение иммунологических и генетических факторов регуляции противотуберкулезного иммунитета позволит не только лучше понять основы патогенеза заболевания, но и оптимизировать подход к его профилактике. В работе изучали иммунный ответ при разивитии ТБ и связь полиморфного варианта rs2069705 (Т-1488С) гена IFNG с выраженностью специфических иммунологических реакций у детей.
ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ
Проспективное исследование было проведено в 2014–2016 гг. В нем приняли участие 310 пациентов в возрасте до 18 лет, которые были разделены на 3 группы в зависимости от степени выраженности туберкулезной инфекции: 110 детей — с установленным ТБ (группа ТБ; средний возраст —9,5 ± 0,5 года, каждый второй ребенок (46,6 %) — в возрасте до 8 лет); 156 детей — с латентной туберкулезной инфекцией (ЛТИ), установленной по результатам туберкулинодиагностики при исключении ТБ (группа ЛТИ; средний возраст — 6,6 ± 0,3 года, 70,5 % детей — в возрасте до 8 лет); 44 ребенка, не инфицированных МБТ (группа НТ; средний возраст — 3,1 ± 0,4 года, 95,5 % детей — в возрасте до 8 лет). Группы детей не различались по половому признаку (р > 0,05).
Всем детям были проведены специфические иммунологические исследования, 169 — также молекулярно-генетические. Сравнение данных об иммунном статусе провели только среди детей до 8 лет, чтобы сопоставление результатов было корректным.
Диагноз «туберкулез» ставили по итогам комплексного обследования, включавшего различные лабораторные, в том числе бактериологические, молекулярно-генетические, лучевые методы исследования. Учитывали результаты туберкулинодиагностики: пробы Манту с 2 туберкулиновыми единицами (ТЕ) туберкулина (PPD-L) и пробы с аллергеном туберкулезным рекомбинантным (АТР) с использованием «Диаскинтест» («Генериум», Россия), который содержит 0,2 мкг рекомбинантного белка CFP10– ESAT6. Диагноз подтверждался центральной врачебно-контрольной комиссией.
В группе ТБ у 23 детей установили инфильтративный туберкулез легких, у 38 — первичный туберкулезный комплекс, у 46 — туберкулез внутригрудных лимфатических узлов (в одном случае сочетался с поражением верхнедолевого бронха слева), по одному случаю пришлось на очаговый и диссеминированный туберкулез легких и туберкулезный плеврит. В 4 случаях регистрировали сочетанное поражение туберкулезом иных органов: периферических лимфатических узлов, плечевой кости, кишечника. Также в 4 случаях наблюдали осложненное течение туберкулезного процесса (ателектаз, экссудативный плеврит, легочная диссеминация, кровохарканье). У 60,9 % (n = 67) пациентов установили туберкулез в фазе инфильтрации, у 10,9 % (n = 12) — в фазе распада и обсеменения, у 0,9 % (n = 1) — уплотнения и рассасывания, у 26,4 % (n = 29) — в фазе кальцинации. Бактериовыделение зарегистрировали в 12 случаях (10,9%), из них в 6 — была установлена лекарственная устойчивость к основным противотуберкулезным препаратам.
В группе ЛТИ у 75 детей установили ранний период первичной туберкулезной инфекции (РППТИ), а у 81 ребенка — инфицирование МБТ более одного года.
В группе НТ у 21 ребенка установили поствакцинальную аллергию, у 23 — положительную туберкулиновую анергию.
У детей, включенных в группу ТБ, средний размер инфильтрата по результатам туберкулинодиагностики (проба Манту) составил 12,6 ± 0,4 мм (95 % CI 11,8–13,5 мм), по результатам пробы с АТР — 14,95 ± 0,5 мм (95 % CI 13,9–16,0 мм). У детей в группе ЛТИ средние значения составили 10,3 ± 0,3 мм (95 % CI 9,7–10,9 мм) и 1,9 ± 0,4 мм (95 % CI 1,2–2,65 мм) соответвенно . В группе НТ у детей с поствакцинальной аллергией средний размер инфильтрата по результатам пробы Манту составил 4,1 ± 0,4 мм (95 % CI 3,2–5,0 мм), при этом положительные реакции были отмечены в 9 случаях (42,9 %), в остальных — сомнительные. По результатам пробы с АТР у всех детей в этой группе зарегистрировали отрицательные реакции.
Мы располагали данными о противотуберкулезной вакцинации детей. Эффективность вакцинации оценивали по рубцу на месте введения вакцины БЦЖ (бацилла Кальметта–Герена; bacillus Calmette–Guerin, BCG) и реакции на туберкулин при проведении пробы Манту год спустя поcле прививки: при формировании рубца длиной 4–10 мм и положительной реакции на туберкулин вакцинацию расценивали как эффективную, при отсутствии рубца и отрицательной реакции на туберкулин — как неэффективную, в остальных случаях — как малоэффективную. В группе ТБ были вакцинированы 108 детей (98,2 %), но эффективной вакцинация была только для 31 ребенка. В группе ЛТИ были привиты 155 детей (99,4 %), эффективно — большинство (n = 97). В группе НТ вакцину получили 36 детей (81,8 %), она была эффективной в каждом четвертом случае.
Иммунологические и молекулярно-генетические исследования проводили на базе Омского научно-исследовательского института природно-очаговых инфекций при поступлении пациента в специализированный стационар и постановке на учет в противотуберкулезном диспансере.
Для оценки иммунного статуса выполнили стандартные иммунологические скрининговые тесты I уровня: определение содержания в сыворотке крови иммуноглобулинов IgG, IgА, IgМ и IgЕ методом иммуноферментного анализа; оценку фагоцитарной активности нейтрофилов определением их способности поглощать инертные частицы латекса и тестированием с нитросиним тетразолием (НСТ-тест) в двух вариантах теста — спонтанном и стимулированном; оценку субпопуляционного состава Т-клеток (CD) с использованием панели моноклональных антител (DAKO, Дания). Также определяли содержание спонтанно синтезируемого интерферона гамма и интерферона гамма, синтез которого был индуцирован в течение 72 ч специфическими антигенами (PPD-L, CFP32B, Rv2660c, ESAT6, 85a, ESAT6- CFP10), с использованием ИФА-тест-системы компании «Вектор-Бест» (Россия). Антигены были выделены в лаборатории трансляционной биомедицины отдела генетики и молекулярной биологии бактерий Национального исследовательского центра эпидемиологии и микробиологии имени Н. Ф. Гамалеи (Москва) [14].
ДНК выделяли из сыворотки крови с помощью набора реагентов «ДНК-кровь» («ТестГен», Россия), идентификацию полиморфного маркера rs2069705 гена IFNG в образцах проводили на амплификаторе iQ5 (BioRad, США) с использованием набора реагентов для полимеразной цепной реакции в модификации Flash («ТестГен») согласно инструкциям производителей. Генотипы анализировали в программном модуле «Дискриминация аллелей», поставляемом производителем амплификатора. Распределение частот генотипов проверяли на соответствие закону Харди–Вайнберга.
Минимальный размер выборки пациентов, достаточный для получения доказательных данных, был рассчитан в программе OpenEpi v3.0. Достоверность различий между группами определяли с помощью непараметрических критериев Краскела–Уоллиса (H), Манна–Уитни (U) и χ2. Различия считали достоверными при р < 0,05. Рассчитывали отношение шансов (odds ratio, OR): если шанс (риск) был выше 1, развитие заболевания считали статистически значимым. Полученные данные обрабатывали с использованием программ OpenEpi v3.0 и Statistica v6.0.
Исследование было одобрено этическим комитетом Омской государственной медицинской академии (протокол № 51 от 10.10.2012). Родители или их законные представители подписали добровольное информированное согласие на участие детей в исследовании.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Данные сравнительного анализа результатов клинического и лабораторного обследования детей из групп ТБ и ЛТИ представлены в табл. 1. У детей с ЛТИ реже (9 %), чем у детей с ТБ (19,1 %), регистрировали проявления интоксикационного синдрома (р = 0,008) и чаще — нарушения носового дыхания за счет аденоидных вегетаций (16 % против 1,8 %, р = 0,00008), очаги хронической инфекции (18,6 % против 10 %, р = 0,027), проявления респираторного аллергоза (15,4 % против 0 %, р = 0,000008) и избыточную массу тела (10,3 % против 4,5 %, р = 0,044). Для группы ТБ были значимыми такие клинические симптомы, как гепато- и спленомегалия (OR 2,583 и 3,800 соответственно) и дефицит массы тела (OR 1,898). По данным лабораторного исследования крови, также были значимыми анемия (OR 1,872), ускорение СОЭ (OR 2,255), лимфоцитоз (OR 1,634) и эозинофилия (OR 5,371). Важно отметить, что только в 4 случаях эозинофилии из 40 она была обусловлена паразитарными инвазиями.
Результаты оценки иммунного статуса всех детей, участвовавших в исследовании, представлены в табл. 2. Достоверных различий по иммунологическим показателям между детьми с ЛТИ и детьми, не инфицированными МБТ, не было (р > 0,05) за исключением содержания спонтанно синтезируемого ИФН-γ (р < 0,05). Для всех групп отмечено незначительное в сравнении с референсными значениями повышение содержания лейкоцитов, характеризующих клеточное звено иммунитета, что может свидетельствовать о его активации за счет неспецифических процессов. При этом достоверными были различия для СD16, HLA DR и спонтанно синтезируемого ИФН-γ. В группе ТБ наблюдали активацию гуморального звена иммунитета: повышение в пределах референсных значений содержания IgG, IgA и значительное повышение IgE — до 306,6 ± 130,7 МЕ/мл. Фагоцитарная активность клеток также значимо возросла, а резервные возможности нейтрофилов снизились. Для всех перечисленных показателей изменения были статистически значимыми при сравнении с результатами в группе НТ.
Таким образом, иммунный статус детей с ЛТИ не отличался от такового у детей, не инфицированных МБТ, при этом наблюдали слабо выраженную активацию клеточного иммунитета. В группе ТБ признаков, указывающих на развитие иммунодефицита, также не установили, однако отмеченные изменения харктеризовали воспалительный процесс при ТБ у детей, в том числе приобретение им черт хронического процесса, в первую очередь за счет недостаточной функциональной активности клеток и недостаточной выработки интерферона гамма.
Для понимания вклада гена IFNG в механизм иммунологической защиты против МБТ мы исследовали его полиморфизм rs2069705. Среди детей с ТБ гетерозиготный генотип встречался в 51,9 % случаев, была установлена его ассоциация с заболеванием (OR 1,885; 95 % CI 1,019– 3,487). Он встречался чаще среди детей как с вторичными (65 %), так и с первичными (47,5 %) формами туберкулеза, что позволяет говорить о высоком риске развития заболевания независимо от его генеза. Также установлена связь гетерозиготного генотипа с формированием инфильтратов (OR 1,737) с признаками деструкции (OR 1,458) легочной ткани, диссеминации (OR 1,75) и плеврального выпота (OR 1,9), с бактериовыделением (OR 1,458) и такими клиническими проявлениями туберкулеза, как параспецифические реакции (OR 2,059), периферическая лимфаденопатия (OR 2,4), дефицит массы тела (OR 1,429), гепато- и спленомегалия (OR 5,5), анемия (OR 2,059), повышение СОЭ (OR 3,4).
Учитывая ассоциацию полиморфизма rs2069705 гена IFNG с адаптивным иммунитетом к туберкулезной инфекции, мы оценили эффективность вакцинации БЦЖ в контексте генотипов среди детей, у которых был установлен ранний период первичной туберкулезной инфекции (n = 32). В 12 случаях вакцинация была мало- или неэффективной, в половине из них у детей был гетерозиготный генотип. Вероятность низкой эффективности вакцинации составила 59,38 % (95 % CI 42,23–74,62 %). Среди детей, у которых прививка была эффективной (n = 20), чаще регистрировали гомозиготный генотип по аллелю Т (40 %).
В исследованиях Д. С. Ожеговой [7] было установлено, что от полиморфизма Т-1488C гена IFNG зависит уровень его экспрессии, поэтому мы предположили, что возможна связь изучаемых генотипов с уровнем синтеза интерферона гамма. При анализе содержания спонтанно синтезируемого ИФН-γ не было установлено значимых различий в зависимости от генотипа как среди детей с ЛТИ (H = 1,663; р = 0,435), так и с ТБ (H = 4,810; р = 0,090). Анализ содержания ИФН-γ, синтез которого был индуцирован специфичными антигенами [15], показал, что при развитии ТБ существует связь между генотипом и уровнем синтеза цитокина: при гетерозиготном генотипе содержание ИФН-γ под влиянием антигенов CFP32B, Rv2660c, ESAT6, Ag85a значимо снижалось (табл. 3). Учитывая это, мы также проанализировали частоту отрицательных результатов — отсутствие ответа на индукцию у детей, больных ТБ (табл. 4) — и определили связь с гетерозиготным генотипом. Подтвердилось наличие его ассоциации со снижением уровня синтеза ИФН-γ при индукции антигенами PPD-L, CFP32B, Rv2660c, ESAT6, 85a и ЕSAT6-CFP10.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
У подавляющего большинства инфицированных МБТ людей отсутствуют симптомы туберкулеза, и, хотя они не являются заразными, есть риск развития активной формы ТБ. По оценкам экспертов, риск реактивации ТБ в течение жизни для пациента с ЛТИ составляет 5–10 %, причем чаще всего он реализуется в течение 5 лет с момента первичного инфицирования [16, 17]. Тем не менее, по мнению ряда исследователей, этот риск зависит от нескольких факторов, наиболее важным из которых является иммунный статус организма [18, 19, 20, 21]. Результаты нашего исследования позволяют говорить о наличии специфического воспалительного процесса и отсутствии вторичного иммунодефицита.
Мы изучали ИФН-γ, основная функция которого — иммунорегуляция, включая активацию макрофагов, усиление Th-1-опосредованного ответа, индукцию экспрессии антигенов MHC типа II на антигенпрезентирующих клетках и др. [22]. При активации клеточного иммунитета продуцентами ИФН-γ являются активированные Тh1-лимфоциты (основной активационный маркер — HLA DR) и натуральные клетки-киллеры (CD16), следовательно, наблюдаемое в нашем исследовании снижение количества NK-клеток (natural killer cells, NK cells) при ТБ могло привести к снижению уровня синтеза цитокина, а недостаток ИФН-γ мог стать причиной сниженной активности цитотоксических клеток. Этим можно объяснить факт повышения содержания спонтанно синтезируемого ИФН-γ еще при ЛТИ (р < 0,05), при этом можно предположить, что антигенная нагрузка не создавала условия для гиперактивации клеточного ответа. В период развития ТБ этот показатель оставался на уровне, характерном для ЛТИ (р > 0,05). Учитывая повышенное содержание спонтанно синтезируемого ИФН-γ, можно было бы предположить, что содержание IgE будет невысоким, т. к. ИФН-γ, будучи продуктом Тh1-лимфоцитов, ингибирует пролиферацию Тh2-лимфоцитов и индуцированное IL4 переключение синтеза Ig на IgЕ, а вместо этого способствует синтезу IgG2 [23]. Однако в нашем случае при развитии ТБ был отмечен высокий уровень синтеза IgE, и это может свидетельствовать о недостаточной продукции ИФН-γ и формировании хронического воспаления. Рядом исследователей установлена прямая связь между возникновением очагов хронической бактериальной или грибковой инфекции и гиперпродукцией IgE [24, 25, 26].
ИФН-γ также рассматривается как важнейший фактор активации макрофагов [22]. Макрофаги лизируют МБТ, обеспечивая антимикобактериальную защиту, в том числе через регуляцию синтеза про- и противовоспалительных цитокинов [27, 28]. Однако каков баланс клеток и медиаторов, необходимых для уничтожения МБТ и предотвращения патологии легких, до конца неясно, этот вопрос изучается [29]. В нашем исследовании отмечено снижение фагоцитарной активности клеток (снижение резервных возможностей нейтрофилов) при развитии ТБ, что также может свидетельствовать о недостаточной продукции ИФН-γ.
В работах М. М. Авербаха высказывалась гипотеза о существовании в лимфоцитах генов, контролирующих активацию клеток, синтезирующих медиаторы, и депрессии одного участка генома при депрессии другого участка, что может нарушать межклеточное взаимодействие при ТБ [30]. Исследователи пытаются установить генетические факторы риска ТБ [8, 9], в том числе активно изучают ген IFNG, который связан с продукцией цитокина ИФН-γ [3, 9] и полиморфизм T-1488C которого влияет на синтез регуляторного белка [7]. В нашем исследовании маркером высокого риска развития ТБ являлся его гетерозиготный генотип по изучаемому генетическому локусу (OR 4,667, 95 % CI 1,236–17,62; р = 0,008), при этом — как при первичном, так и вторичном по генезу варианте заболевания. Косвенным показателем этого является и низкая эффективность вакцинации БЦЖ, установленная в группе детей в ранним периодом первичной туберкулезной инфекции. Некоторые исследователи также рассматривают низкую эффективность прививки как фактор риска развития ТБ [18, 31]. Было также определено, что изучаемый полиморфизм гена IFNG (гетерозиготный генотип) ассоциирован с иммунным ответом против отдельных микобактериальных антигенов при развитии ТБ: отметили значительное снижение ответа на белки ранней стадии развития туберкулезной инфекции — CFP32B, Rv2660c, ESAT6, 85a [15] и незначительное снижение уровня синтеза ИФН-γ при индукции PPD-L и ЕSAT6-CFP10, что еще раз подчеркивает важность оценки данных антигенов для ТБ. Также была определена протективная роль гомозиготного генотипа по аллелю Т и его связь с формированием противотуберкулезного иммунитета у детей.
Таким образом, результаты исследования позволяют рассматривать полиморфизм гена IFNG (Т-1488C) в качестве дополнительного генетического фактора риска развития туберкулезной инфекции у детей и одной из причин недостаточной функциональной активности клеток, регулирующих синтез ИФН-γ.
ВЫВОДЫ
Оценивая иммунный ответ при развитии туберкулезной инфекции, установили активацию клеточного звена иммунитета, а при ее прогрессировании (от латентной к активной) недостаточную функциональную активность клеток. В качестве основного цитокина адаптивного иммунитета рассматривали ИФН-γ.
Выявлена связь полиморфизма T-1488C гена IFNG с выраженностью специфических иммунологических реакций. Гетерозиготный генотип связан с недостаточной продукцией цитокина на белки ранней стадии развития туберкулезной инфекции. Гомозиготный генотип по аллелю Т — с формированием протективного иммунитета.
Установлено, что гетерозиготный генотип полиморфного варианта гена IFNG (rs2069705) связан с развитием туберкулеза у детей с ЛТИ, что позволяет данный генотип рассматривать в качестве дополнительного фактора риска заболевания.