Качественные характеристики скрининговых тест-систем при проведении масштабных сероэпидемиологических исследований играют решающую роль. Современные тест-системы позволяют проводить скрининг антител против различных инфекций, входящих в национальный календарь вакцинации, и разрабатываются под оборудование, использующее технологии мультиплексного суспензионного анализа. Этот подход позволяет существенно уменьшить требуемый для анализа объем сыворотки крови, увеличить скорость проведения исследования, снизить его стоимость. Между тем проблемой является полное отсутствие коммерчески доступных мультиплексных тест-систем, готовых для использования в сероэпидемиологических исследованиях. Потребителями таких тест-систем являются в основном лаборатории, проводящие масштабные серологические исследования и изучающие в их рамках десятки тысяч образцов. Тем не менее объем рынка пока все же небольшой, и, кроме того, коммерческий потенциал тест-систем подрывает отсутствие унифицированных требований по составу определяемых антител со стороны потенциальных заказчиков. Это указывает на необходимость разработки мультиплексных тест-систем самими лабораториями, но решение таких задач требует высокой квалификации персонала: необходимо владение специальными методами для разработки и валидации тест-системы, которая будет использоваться для скрининга.

В данной работе приводится протокол разработки тест-системы для проведения мультиплексного иммунного анализа (МИА) антител к вакциноуправляемым инфекциям на примере кори, паротита, краснухи и гепатита B (рис. 1). Обсуждаются потенциальные сложности каждого этапа и пути их преодоления. Данная методика используется в лаборатории трансляционной биомедицины Национального исследовательского центра эпидемиологии и микробиологии имени Н. Ф. Гамалеи (Москва). Детально описывается последовательность проведения работы на каждом из этапов на примере реальных данных. Мы надеемся, что приведенный протокол и демонстрация реальных данных сложностей станет отправной точкой для разработки мультиплексных суспензионных тест-систем в других лабораториях, что сделает получение данных об иммунологической памяти населения России к вакциноуправляемым инфекциям более эффективным и удобным.

I. Дизайн эксперимента

Рассмотренный здесь метод непрямого (серологического) иммуноанализа на магнитных микросферах и разрабатываемая тест-система были созданы на основе рекомендаций компании Luminex (США), производителя микросфер MagPlex^TM-C и анализатора MAGPIX [1], анализа литературы [2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10], в том числе серии руководств по планированию иммунологических исследований [11, 12, 13] и валидации тест-систем [11, 14, 15, 16], а также на основе собственных наработок.

Суть предлагаемого метода заключается в детекции антител в образцах крови с помощью антигенов (АГ), ковалентно связанных с поверхностью магнитных микросфер, и детектирующих антител (козьи антитела против IgG человека), коньюгированных с флюорохромной меткой фикоэритрином. Данный метод отличается от классических иммунометрических методов, например иммуноферментного анализа (ИФА), более широким динамическим диапазоном и возможностью одновременного определения до 50 отдельных аналитов, если для детекции сигнала использовать прибор MAGPIX. Общая схема метода показана на рис. 1.

Данный метод использовался для разработки тест-системы для мультиплексного иммунного анализа, общая схема процесса показана на рис. 2.

Разрабатываемая тест-система предназначена для одновременной детекции IgG против вируса кори, краснухи, эпидемического паротита и вируса гепатита B (anti-HBs) в сыворотке крови человека. Вся процедура пробоподготовки по протоколу готовой методики занимает 1 ч, включая инкубации, плюс около 10 мин отводится на распределение реактивов и отмывки. Анализ на приборе, если используется 96-луночный планшет, занимает около 40 мин. Т. е. время от начала до получения результата составляет менее 2 ч. Рассмотрим подробнее основные этапы разработки тест-системы.

II. Получение моноплексных суспензий

1. Материалы

Для создания моноплексных суспензий необходимы следующие компоненты:

• антигены патогенов, для детекции IgG к которым предназначена мультиплексная тест-система (вирусы кори, эпидемического паротита, краснухи и гепатита B);
• магнитные карбоксилированные микросферы четырех различных регионов (MagPlex^TM-C);
• выборка сывороток, предварительно охарактеризованных с помощью лицензированной в России тест-системы;
• детектирующие антитела — антитела к IgG человека, конъюгированные с фикоэритрином (PE-Conjugated Goat Anti-Human IgG; One Lambda, Thermo Fisher Scientific, США).

К выбору антигенов подходили, исходя из цели создания мультиплекса. В данном случае основной целью работы была оценка популяционного иммунитета к вакциноуправляемым заболеваниям человека. Вакцины для профилактики заболеваний, вызываемых вирусами кори, краснухи и эпидемического паротита, зарегистрированные в России, являются живыми, поэтому были выбраны прежде всего нативные антигены. Также в разработку были включены и рекомбинантные АГ. Вакцинные препараты для профилактики гепатита B содержат рекомбинантный поверхностный антиген вируса (HBsAg) одного из двух субгенотипов ayw и adw, поэтому они и были выбраны для четвертого компонента мультиплексной суспензии (табл. 1).

Для того чтобы иметь возможность определять IgG одновременно к четырем патогенам в одной реакции, необходимо иметь набор из соответствующего количества так называемых «регионов» магнитных микросфер (MagPlex^TM-C). Магнитные микросферы MagPlex, составляющие основу технологии xMAP, имеют микроскопические размеры (диаметр — 6,5 мкм) и окрашены различными концентрациями 2–3 флуорохромов, что позволяет создавать до 500 различных вариантов, или регионов, а, следовательно, и мультиплексные суспензии для детекции до 500 мишеней в одном образце. Магнитные свойства микросфер упрощают выполнение протоколов иммунных анализов таким образом, что с помощью магнитного штатива, на который помещается 96-луночный полистироловый планшет, можно простым встряхиванием удалить ту или иную жидкость из лунки, при этом примагниченные микросферы с иммунокомплексом останутся в ней.

Создание мультиплексной тест-системы включало в себя не только разработку набора микросфер, конъюгированных с антигенами, но и оценку работы этой мультиплексной суспензии на тестовых образцах — сыворотках крови человека. Панель сывороток должна включать образцы, охарактеризованные общепринятым, лицензированным методом. Мы использовали 98 образцов сывороток, охарактеризованных с помощью ИФА-тест-систем производства компании «Вектор-Бест» (Россия) и автоматических иммунологических анализаторов BioPlex (краснуха, корь; Bio-Rad, США), Architect (краснуха, гепатит B; Abbott, США), Liason (эпидемический паротит; DiaSorin, Италия) и Immulite (краснуха; Siemens, Германия). Для сохранности сывороток и предотвращения многократных циклов замораживания–оттаивания все образцы были разведены в соотношении 1 : 2 предварительно автоклавированным 100 % глицерином и хранились при –20 °С.

Визуализацию иммунокомплексов «микросфера – антиген – IgG» осуществляли с помощью детектирующих антител. Для этого применяли широко используемый препарат козьих антител, конъюгированных с фикоэритрином, который избирательно взаимодействует только с тяжелыми цепями IgG человека (PE-Conjugated Goat Anti-Human IgG).

Для количественного определения антител в сыворотке крови была построена калибровочная кривая, относительно которой в дальнейшем определяли концентрацию IgG для исследуемого образца в международных единицах в миллилитре (МЕ/мл).  Существуют международные стандарты (International Standarts, IS), содержащие известное количество иммуноглобулинов к тому или иному патогену, однако они поставляются в ограниченных количествах и поэтому использовались нами для калибровки вторичных стандартов (Secondary Standarts, SS) на основе имеющихся сывороток. В эксперименте использовали IS Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) из коллекции Национального института биологических стандартов и контролей (NIBSC, Великобритания) (табл. 2). SS в свою очередь являлись внутренним стандартом для создаваемой мультиплексной суспензии, относительно которого в дальнейшем отбирались калибровочные стандарты для каждого анализа [11]. Т. к. для эпидемического паротита стандартов IS ВОЗ не существует, в качестве SS использовали калибровочные образцы одной из коммерческих тест-систем. Также в состав иммунологических тест-систем входят сыворотки человека для контроля качества работы тест-системы, добавляемые как отдельные образцы. Мы использовали контроли из коллекции NIBSC (табл. 2).

2. Сенсибилизация микросфер — получение моноплексных суспензий

При разработке тест-системы были использованы два способа сенсибилизации микросфер. Оба они основаны на реакциях карбодиимидной химии, и один является модификацией другого. Для нативных антигенов краснухи и паротита, а также для рекомбинантного антигена кори использовали протокол ковалентного связывания антигена с поверхностью микросферы при помощи двухэтапной карбодиимидной химической реакции. Такой способ рекомендован, если сенсибилизирующая молекула имеет размер более 10 кДа. Для молекул менее 10 кДа, каким являлись рекомбинантные HBsAg, микросферы были предварительно, посредством одноэтапной карбодиимидной химической реакции, модифицированы химическим спейсером — дигидразидом адипиновой кислоты (ADH), с которым уже на втором этапе также карбодиимидной химической реакцией проводилось связывание АГ со спейсером на поверхности микросфер. Это было необходимо для поднятия маленького пептида над шероховатой поверхностью микросферы и обеспечения возможности реакции между АГ и аналитом.

2.1 Cенсибилизация микросфер двухэтапной карбодиимидной химической реакцией (для сенсибилизации 10⁶ микросфер)

Необходимые для процесса сенсибилизации микросфер растворы готовились в дистиллированной воде (дH₂O) с использованием следующих реактивов:

• NaH₂PO₄H₂O для активационного буфера (0,1 M NaH₂PO₄, pH 6,2);
• MES гидрат для буфера для связывания (50 мМ MES, pH 5,0);
• фосфатно-солевой буферный раствор с добавлением 0,02 % Tween-20, 0,1 % BSA, 0,05 % NaN₃, pH 7,4 (далее — PBS-TBN) — промывочный буфер;
• 1-этил-3-[3-диметиламинопропил]карбодиимид гидрохлорид (EDC) и N-гидроксисульфосукцинимида натриевая соль (s-NHS) — концентрация 50 мг/мл для каждого реагента. Готовятся непосредственно перед использованием;

Необходимое оборудование:

• магнитный штатив для 1,5 мл пробирок типа Eppendorf;
• ультразвуковая ванна;
• центрифуга типа Vortex;
• лабораторный ротатор;
• автоматический счетчик клеток или камера Горяева и микроскоп;
• пробирки low-bind 1,5 мл типа.

Протокол двухэтапной карбодиимидной коньюгации:

– подготовка  микросфер:

1. флакон с микросферами перемешать на ротаторе в течение 2 мин при 20 об./мин;
2. необходимое количество микросфер перенести в пробирку, «заводской» объем довести до 250 мкл дH₂O;
3. вортекс/соникация — 20 с, поместить на магнитный штатив (далее — магнит) на 1 мин, удалить надосадочную жидкость;

– активация микросфер:

4. добавить в пробирку 80 мкл буфера для активации, вортекс — 20 с;
5. добавить по 10 мкл EDC и s-NHS, вортекс — 20 с;
6. оставить на 20 мин, перемешивая на вортексе по 20 с каждые 10 мин;

– отмывка № 1:

7. магнит — 1 мин, удалить надосадочную жидкость;
8. добавить в пробирку 250 мкл буфера для связывания;
9. вортекс/соникация — 20 с, магнит — 1 мин, удалить надосадочную жидкость;
10. повторить п. 8 и 9;

– сенсибилизация микросфер:

11. добавить в пробирку 100 мкл буфера для связывания, вортекс/соникация — 20 с;
12. добавить в пробирку необходимое количество антигена (табл. 3);
13. довести буфером для связывания объем до 500 мкл;
14. поместить пробирку на ротатор на 120 мин. при 20 об./мин в темное место;

– отмывка № 2:

15. магнит — 1 мин, удалить надосадочную жидкость;
16. добавить в пробирку 1000 мкл промывочного буфера;
17. вортекс/соникация — 20 с, магнит — 1 мин, удалить надосадочную жидкость;
18. повторить п. 16 и 17 еще 2 раза;

– завершение процедуры:

19. ресуспендировать микросферы в 1000 мкл буфера для хранения. Это может быть PBS-TBN или любой другой блокирующий буфер (определяется экспериментально);
20. измерить концентрацию микросфер на счетчике клеток или в камере Горяева. Исходя из этой цифры, рассчитать объем микросфер для приготовления в МИА;
21. сенсибилизированные микросферы хранить в темном месте на +4 °C и использовать в анализе через 16 ч (на следующий день).

2.2 Cенсибилизация микросфер двукратной одноэтапной карбодиимидной химической реакцией через спейсер (для сенсибилизации 1,5*10⁶ микросфер)

Необходимые для процесса сенсибилизации микросфер растворы готовили в дистиллированной воде (дH₂O) с использованием следующих реактивов:

• MES гидрат для буфера для связывания (0,1 M MES, pH 6,0);
• MES гидрат для промывочного буфера № 1 (0,1 M MES, pH 4,5);
• фосфатно-солевой буферный раствор с добавлением 0,02 % Tween20, 0,1 % BSA, 0,05 % NaN₃, pH 7,4 (далее — PBS-TBN) — промывочный буфер № 2;
• раствор ADH в концентрации 100 мг/мл в буфере для связывания;
• EDC в концентрации 100 мг/мл в дH₂O. Для п. 7 и для п. 19 готовить раствор отдельно.

Необходимое оборудование:

• магнитный штатив для 1,5 мл пробирок типа Eppendorf;
• ультразвуковая ванна;
• центрифуга типа Vortex;
• лабораторный ротатор;
• автоматический счетчик клеток или камера Горяева и микроскоп;
• пробирки low-bind 1,5 мл типа Eppendorf.

Протокол двукратной одноэтапной карбодиимидной коньюгации:

– подготовка  микросфер:

1. флакон с микросферами перемешать на ротаторе в течение 2 мин при 20 об./мин;
2. необходимое количество микросфер перенести в пробирку, «заводской» обьем довести до 250 мкл дH₂O;
3. вортекс/соникация — 20 с, магнит — 1 мин, удалить надосадочную жидкость;
4. добавить в пробирку 500 мкл буфера для связывания;
5. вортекс/соникация — 20 с, магнит — 1 мин, удалить надосадочную жидкость;

– сенсибилизация микросфер спейсером:

6. добавить в пробирку 30 мкл ADH (1 мг вещества на 500 000 микросфер);
7. добавить в пробирку 30 мкл EDC (1 мг вещества на 500 000 микросфер);
8. довести объем до 500 мкл буфером для связывания;
9. поместить пробирку на ротатор на 60 мин при 20 об./мин в темное место;

– отмывка № 1:

10. магнит — 1 мин, удалить надосадочную жидкость;
11. добавить в пробирку 500 мкл буфера для промывки № 1;
12. магнит — 1 мин, удалить надосадочную жидкость;
13. повторить п. 11 и 12 еще 2 раза;

– завершение процедуры сенсибилизации микросфер спейсером:

14. ресуспендировать микросферы в 1 000 мкл буфера для промывки № 1;
15. измерить концентрацию микросфер на счетчике клеток или в камере Горяева. Исходя из этого числа, рассчитать количество антигена для связывания;

– сенсибилизация микросфер со спейсером:

16. вортекс/соникация — 20 с, магнит — 1 мин, удалить надосадочную жидкость;
17. добавить в пробирку 100 мкл буфера для связывания, вортекс/соникация — 20 с;
18. добавить в пробирку необходимое количество пептида (табл. 3);
19. добавить в пробирку 30 мкл EDC (1 мг вещества на 500 000 микросфер);
20. довести объем до 500 мкл буфером для связывания;
21. поместить пробирку на ротатор на 120 мин при 20 об./мин в темное место;

– отмывка № 2:

22. магнит 1 мин, удалить надосадочную жидкость;
23. добавить в пробирку 1 000 мкл промывочного буфера № 2;
24. вортекс/соникация — 20 с, магнит — 1 мин, удалить надосадочную жидкость;
25. повторить п. 23 и 24 еще 2 раза;

– завершение процедуры:

26. ресуспендировать микросферы в 1 000 мкл буфера для хранения. Это может быть PBS-TBN или любой другой блокирующий буфер (определяется экспериментально). В данной тест-системе для моноплекса гепатита В используется PBS-TBN;
27. измерить концентрацию микросфер на счетчике клеток или в камере Горяева. Исходя из этой цифры, рассчитать объем микросфер для приготовления в МИА;
28. сенсибилизированные микросферы хранить в темном месте на +4 °C и использовать в анализе через 16 ч (на следующий день).

3. Протокол постановки мультиплексного непрямого (серологического) иммунного анализа

Прежде чем проверять параметры мультиплексной тест-системы, важно оценить работу каждой моноплексной суспензии по отдельности и подобрать оптимальные условия, общие для всех моноплексных систем. Такую оценку включает этап «Определение общего оптимального режима проведения МИА для всех моноплексов» (п. 3 на рис. 2). Для этого анализируются сыворотки по протоколу, описанному ниже.

Необходимые материалы:

• 96-луночный полистироловый планшет (далее — планшет);
• микропробирки объемом 0,5, 1,5 и 2 мл;
• набор охарактеризованных по наличию целевых IgG сывороток;
• суспензии готовых микросфер, коньюгированных с антигенами;
• стоковый 100-кратный раствор коньюгата детектирующих антител с фикоэритрином;
• фосфатно-солевой буферный раствор PBS-TBN.

Необходимое оборудование:

• магнитная подставка для планшета Magnetic Plate Separator (Luminex);
• центрифуга типа Vortex;
• термошейкер;
• ультразвуковая ванна;
• анализатор MAGPIX (Luminex).

Протокол проведения анализа:

1. заранее включить нагрев термошейкера до +37 °С и анализатор MAGPIX;
2. приготовить разведение сыворотки 1 : 50 буферным раствором PBS-TBN в микропробирках;
3. приготовить суспензию микросфер из расчета 2 500 микросфер на одну реакцию (одну лунку в планшете) в объеме 50 мкл:

• вортекс/соникация — 20 с,
• отобрать нужный объем суспензии в новую пробирку и довести объем суспензии до расчетного буферным раствором PBS-TBN;

4. в планшет внести по 50 мкл готовой суспензии микросфер и 50 мкл разведенной сыворотки (в итоге сыворотки тестируются в разведении 1 : 100);
5. первая инкубация (30 мин, +37 °С): закрепить планшет в термошейкере и установить режим перемешивания 800 об./мин и таймер на 30 мин;
6. во время первой инкубации приготовить раствор детектирующих антител: отобрать нужное количество стокового раствора антител и приготовить разведение 1 : 100 PBS-TBN из расчета 50 мкл готового раствора детектирующих антител на лунку (итоговая концентрация антител в лунке — 2,5 мкг/мл).
7. снять планшет с термошейкера и установить на магнитную подставку на 2 мин, после чего, не убирая планшет с подставки, удалить жидкость из планшета;
8. отмывка PBS-TBN: в лунки планшета многоканальной пипеткой внести по 100 мкл PBS-TBN, перемешать содержимое лунок на термошейкере в течение 30 с, установить планшет на магнитную подставку на 2 мин, удалить жидкость из планшета, повторить процедуру отмывки еще раз;
9. ресуспендировать микросферы 50 мкл PBS-TBN на лунку;
10. в каждую лунку внести 50 мкл готового раствора детектирующих антител (п. 6);
11. вторая инкубация (30 мин, +37 °С): закрепить планшет в термошейкере и установить режим перемешивания 800 об./мин и таймер на 30 мин;
12. отмывка PBS-TBN: см. п. 8;
13. после отмывки внести по 100 мкл PBS-TBN в каждую лунку, перемешать содержимое лунок на термошейкере в течение 30 с;
14. установить планшет в анализатор MAGPIX и запустить анализ.

Важно отметить, что такие параметры, как температура и время инкубации, разведение сыворотки, концентрация детектирующих антител, вариабельны, и их изменение может привести к увеличению или же снижению интенсивности флуоресценции (MFI — единицы измерения флуоресцентного сигнала в методике). Нахождение выгодных для всех 4 моноплексных систем параметров — суть оптимизации тест-системы.

4. Оптимизация работы моноплексных суспензий

Оптимизация — это неотъемлемая часть создания мультиплексной суспензии. Она подразумевает подбор таких условий для каждого из моноплексов, при которых выполняется ряд требований к тест-системам:

• низкие значения MFI для отрицательного контроля, когда в качестве аналита выступает, например, кроличья сыворотка либо сыворотки человека, в которых отсутствуют все иммуноглобулины;
• как можно больший диапазон значений сигнала между образцами сывороток, содержащими и не содержащими искомые антитела;
• соответствие результатов, полученных с помощью моноплексных суспензий, результатам, полученным референсным методом (ИФА).

Оптимизация затрагивает как общие факторы (температура и время инкубации, разведение сыворотки и раствор для разведения сыворотки, концентрация детектирующих антител), влияющие на все 4 моноплекса, так и частные факторы, которые могут быть для каждой моноплексной суспензии индивидуальными (тип блокирующего буфера для микросфер, концентрация антигена при конъюгации с микросферами, количество микросфер каждой моноплексной суспензии в лунке). По результатам оптимизации вышеперечисленных параметров были выбраны оптимальные условия для всех моноплексных суспензий (табл. 3).

Ввиду того, что некоторые выбранные антигены могут быть рекомбинантными, полученными путем экспрессии их в Escherichia coli, необходимо учесть, что препарат целевого антигена может содержать примеси антигенов этого микроорганизма. Антитела к этой бактерии, потенциально находящиеся в каждой сыворотке человека, могут добавить ложноположительный сигнал в общее значение MFI. Для того чтобы избежать подобного эффекта, в состав буфера для разведения сывороток включали лизат E. coli (3 %), который связывает специфичные к ней иммуноглобулины в исследуемой сыворотке [5].

Еще одним важным пунктом оптимизации тест-системы является оценка кросс-реактивности каждого моноплекса. Желательно в процессе создания тест-системы провести такой тест как можно раньше. Эксперименты на кросс-реактивность показывают, например, насколько исследуемая моноплексная тест-система с антигеном к вирусу кори специфична в отношении детекции антител IgG к вирусу кори и не взаимодействует с антителами к другим инфекциям.

Постановка эксперимента на кросс-реактивность осуществляется по протоколу, описанному выше, при выбранных условиях (табл. 3). Так, сыворотку без антител IgG к вирусу кори, но с антителами IgG к остальным патогенам тестируют с моноплексной суспензией микросфер, конъюгированных с антигеном вируса кори. Таким же образом с помощью аналогично подобранных сывороток поступают с остальными моноплексными суспензиями. Если результаты показывают MFI на уровне предела чувствительности (LOD), то можно утверждать, что моноплексная суспензия не обладает перекрестной реактивностью, в обратном случае потребуется замена АГ.

На данном этапе разработки мультиплексной тест-системы была протестирована панель из 70 сывороток для детекции антител IgG к вирусам краснухи, кори и эпидемического паротита с помощью оптимизированных моноплексных суспензий. Проведение анализа осуществляли в соответствии с выбранными условиями (табл. 3). Результаты отображены на рис. 3, рис. 4, рис. 5 для метода МИА в единицах MFI, поскольку процедура калибровки и превращение тест-системы в количественную только предстоит. Для сравнения использовали результаты, полученные для той же панели сывороток, но с помощью метода ИФА («ВектоРубелла-IgG», «ВектоКорь-IgG», «ВектоПаротит-IgG»; «Вектор-Бест»).

Можно отметить, что дифференциация сывороток, содержащих и не содержащих антитела IgG к вирусу краснухи, с помощью моноплескной суспензии соответствует таковой в системе ИФА (рис. 3). Что же касается кори и паротита, то тут можно отметить достаточно высокие значения MFI для сывороток, не содержащих антитела IgG, которые близки, а в некоторых случаях превышают значения «серой зоны» (рис. 4, рис. 5). Это пример того, что моноплексные суспензии для детекции IgG к вирусам кори и эпидемического паротита требуют дополнительной оптимизации.

Безусловно, без этапа калибровки моноплексных тест-систем для детекции антител IgG к вышеперечисленным вирусам нельзя сравнивать результаты этих двух методов номинально, но все же их получение позволяет до объединения моноплексов в мультиплексную суспензию судить о качестве работы моноплексной суспензии и решить, что дополнительная оптимизация не требуется и данная моноплексная тест-система готова к калибровке.

Созданные пулы сывороток были предварительно протестированы в постановках с моноплексными суспензиями в разведении от 1 : 100 до 1 : 409 600 4-кратным шагом. В результате были получены кривые, позволяющие также преварительно оценить потенциал этих пулов для использования в качестве вторичных стандартов (рис. 6).

III. Получение мультиплексных суспензий

После того, как каждая моноплексная суспензия прошла стадию оптимизации, предварительное тестирование на панели сывороток в сравнении с методом ИФА и был выбран единый режим проведения анализа, необходимо объединить моноплексные суспензии в мультиплекс и выяснить, как результаты, полученные в мультиплексной тест-системе, коррелируют с таковыми, полученными с помощью моноплексных суспензий по отдельности. Для этого осуществляют постановку, где панель сывороток анализируют параллельно с помощью мультиплексной суспензии и с помощью моноплексных суспензий [4], по результатам которой проводят корреляционный анализ.

Создаваемая тест-система для детекции антител IgG к вирусам кори, краснухи, эпидемического паротита и гепатита B в настоящий момент находится на стадии сравнения качественных характеристик моноплексных и мультиплексной суспензий в выбранных условиях. Далее приводится схема с описанием действий по валидации мультиплексной суспензии без примеров по выбранным патогенам.

Ранее на этапе оптимизации упоминалась такая характеристика тест-системы, как специфичность. Определение специфичности тест-системы является неотъемлемой частью валидации (см. п. 3 на ;media_2;). Однако на этапе получения мультиплексной тест-системы специфичность определяется иначе, нежели кросс-реактивность. Проводят тесты гомологичного и гетерологичного ингибирования сывороток антигенами [3, 7, 8, 9, 10, 11]. Для теста на ингибирование необходимо выбрать сыворотку с заведомо известным высоким содержанием антител IgG ко всем 4 патогенам. Из выбранной сыворотки отбирают 4 аликвоты, каждая из которых подвергается предварительной инкубации с одним из 4 АГ. После преинкубации с антигенами к сывороткам добавляют мультиплексную суспензию микросфер. Параллельно в постановку включают контроль, в качестве которого выступает та же самая сыворотка, но без преинкубации с АГ. Гомологичное ингибирование в данном случае показывает специфичность моноплекса в составе мультиплексной системы в отношении гомологичного антигена, а гетерологичное ингибирование является показателем неспецифичной реакции моноплексных суспензий в отношении гетерологичных антигенов. Приемлемые пределы гомологичного и гетерологичного ингибирования — 80–120 % и менее 30 % соответственно.

Если тест-система демонстрирует специфичность в установленных пределах, то следующим шагом является стандартизация тест-системы — ее калибровка по международным стандартам (табл. 2). Для начала нужно отобрать сыворотки с высоким содержанием антител IgG для каждого патогена, сформировать из них положительный пул, возможно, будущий вторичный стандарт. Далее, в рамках одной постановки осуществить раститровку международного стандарта и созданного положительного пула сывороток 4-кратным шагом (в соответствии с рекомендациями [11]), начиная с разведения 1 : 100, с каждой из 4 моноплексных суспензий по протоколу, приведенному ранее, в единых выбранных условиях. По результатам данной постановки проводится построение калибровочных кривых по известным значениям международных стандартов (в МЕ/мл) и полученным в ходе данного эксперимента значениям для тех же стандартов, но в единицах MFI для каждой моноплексной суспензии. Благодаря полученным калибровочным кривым выясняются концентрации каждого аналита в положительном пуле сывороток, после чего проводится построение кривых раститровки и делаются выводы о том, подходит ли данный пул для вторичного стандарта, необходимо ли его предварительное разведение.

Для стандартизации мультиплексной суспензии проводят такую же постановку с раститровкой IS и SS в параллели, но уже в мультиплексной суспензии микросфер. Калибровочные кривые сравнивают с таковыми для моноплексов, полученными на предыдущем этапе, делают вывод об их корреляции. А также сравнивают кривые раститровки IS и SS, после чего делают заключение о пригодности кривой раститровки SS в качестве калибровочной кривой для мультиплексной суспензии.

Далее следует выбор оптимальной математической модели, которая бы наиболее точно описывала полученную калибровочную кривую и применялась в дальнейшем для расчета концентраций антител методом МИА, выраженных уже в международных единицах.

IV. Определение аналитических параметров, валидация и определение диагностической значимости тест-системы

Валидация — серия экспериментов, проводимых с целью достоверной оценки аналитических параметров тест-системы с помощью аттестованного аналитического метода. Цель валидации — удостовериться в возможности успешного использования разработанной тест-системы по назначению, а также определить ограничения при ее использовании в рутинной практике. Аналитических параметров у теста существует довольно много, и часть из них определяется и улучшается практически с самого начала разработки, например описанный выше тест на кросс-реактивность. Получается, что вообще любой эксперимент с сыворотками с заведомо известной концентрацией аналита (по данным какого-либо сертифицированного метода) в рамках создания тест-системы в какой-то степени является частью процесса валидации, или, другими словами, невозможно точно сказать, когда заканчивается создание тест-системы и начинается валидация.

Здесь будут рассмотрены основные аналитические параметры в контексте разрабатываемой тест-системы, а также предполагаемую схему ее валидации.

Чувствительность — это в широком смысле слова способность детектировать определенный аналит, а выразить ее можно через минимальную концентрацию этого аналита, достоверно детектируемую тест-системой. Выделяют аналитическую чувствительность тест-системы, когда делают несколько повторов нулевой пробы (без аналита) и среднее значение полученных результатов плюс 2–3 стандартных отклонения образуют описываемую характеристику. Ее еще называют пределом чувствительности, обнаружения или детекции (LOD). Другими словами, пределом обнаружения можно назвать минимальную концентрацию аналита, достоверно детектируемую (но необязательно количественно) рассматриваемой тест-системой. Выделяют верхний и нижний пределы количественного определения (ULOQ и LLOQ — upper & lover limit of quantification), т. е. максимальное и минимальное количества аналита, которые можно детектировать при определенных параметрах точности и воспроизводимости.

Существует также понятие функциональной чувствительности — минимальной концентрации аналита, при детекции которой в нескольких повторах коэффициент вариации будет меньше определенного значения (10–20 %).

Прецизионность — степень разброса результатов в серии измерений, выполненных с помощью данной тест-системы в отношении одного и того же образца, представляемая в виде коэффициента вариации (CV%). Он отражает степень разброса результатов, полученных в одинаковых условиях. Существует определенная иерархия уровней этого показателя. Выделяют прецизионность внутрипостановочную (вариабельность результатов в дублях/повторах в рамках одного запуска; считается приемлемой на уровне менее 10 %), межпостановочную (вариабельность результатов в рамках нескольких запусков методики; считается приемлемой на уровне менее 20 %), между лотами различных реагентов, между приборами и между различными исследователями, а также выделяют понятие воспроизводимости — прецизионности результатов использования методики между разными лабораториями.

Специфичность — в случае иммунологического метода это способность антитела реагировать только с одним антигеном, причем один из этой пары по совместительству является искомым аналитом. Мера способности антитела реагировать с другими веществами помимо антигена/аналита называется кросс-реактивностью.

Правильность — степень соответствия значения, полученного с использованием методики, и истинного значения измеряемой величины. Обязательная характеристика всех количественных методик, определяемая путем постановки пробы с известной количественной характеристикой аналита в оцениваемой тест-системе. Отношение измеренного к ожидаемому называют степенью извлечения (recovery).

Линейность — способность с помощью методики (в пределах диапазона применения) получать результаты испытаний, прямо пропорциональные концентрации (количеству) анализируемого вещества в образце. Для ус­та­нов­ле­ния ли­ней­нос­ти ме­тоди­ки го­товят се­рию стан­дар­тных рас­тво­ров аналита в ди­апа­зоне кон­цен­тра­ций 50–130 % пу­тем раз­ве­дения ис­ходно­го стан­дар­тно­го рас­тво­ра и про­водят их ко­личес­твен­ное оп­ре­деле­ние сог­ласно раз­ра­ботан­ной ме­тоди­ке. По результатам строится калибровочный график ли­ней­ной за­виси­мос­ти най­ден­ных кон­цен­тра­ций от вве­ден­ных кон­цен­тра­ций (в нор­ма­лизо­ван­ных ко­ор­ди­натах). Для оценки степени линейности рас­счи­тывается ко­эф­фи­ци­ент кор­ре­ляции (r²), угол нак­ло­на кри­вой (slope), зна­чение точ­ки пе­ресе­чения с осью ор­ди­нат (y-intercept).

Диапазон применения тест-системы — это интервал между наибольшей (ULOQ) и наименьшей (LLoQ) концентрацией аналита в анализируемом образце, для которого данная методика имеет приемлемый уровень прецизионности, правильности и линейности.

Помимо аналитических параметров для оценки диагностической значимости разработанной тест-системы при сравнении с референсным методом определяют также и диагностические показатели: диагностическую чувствительность — частоту обнаружения аналита в образцах, содержащих его по результатам применения референсного метода (в&