ISSN Print 2070–7320
ISSN Online 2070–7339
Вестник РГМУ
НАУЧНЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ ЖУРНАЛ РНИМУ ИМЕНИ Н. И. ПИРОГОВА
ОРИГИНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ
Анализ индукции апоптоза лимфоцитов периферической крови человека сверхинтенсивным гамма-излучением in vitro
Информация об авторах
1 Троицкий институт инновационных и термоядерных исследований (ТРИНИТИ),ГК «Росатом», Троицк, Москва
2 Объединенный институт высоких температур РАН, Москва
3 Научно исследовательский институт технической физики и автоматизации,ГК «Росатом», Москва
4 Московский научно-исследовательский онкологический институт имени П. А. Герцена — филиал Национального медицинского исследовательского центра радиологии, Москва
5 Российский научный центр рентгенорадиологии, Москва
Для корреспонденции: Владимир Константинович Боженко
ул. Профсоюзная, д. 86, г. Москва, 117997; ur.liam@oknejobv
Информация о статье
Финансирование: работа выполнена при поддержке ГК «Росатом» и Российского научного фонда (грант № 15-10355).
Вклад всех авторов в работу равнозначен: подбор и анализ литературы, планирование исследования, сбор, анализ и интерпретация данных, подготовка черновика рукописи, внесение исправлений.
Статья получена: 22.11.2017
Статья принята к печати: 05.12.2017
Опубликовано online: 25.01.2018
|
Действенность радиологических методов лечения злокачественных опухолей основана на ряде биологических эффектов, в том числе гибели клеток вследствие лучевого воздействия. Ионизирующее излучение вызывает молекулярные повреждения в органеллах и компартментах клеток, наиболее опасными среди которых являются нарушения структуры ДНК. Их результатом является или гибель клеток, или репарация повреждений ДНК и восстановление нормального жизненного статуса клеток, или возникновение мутаций и индукция канцерогенеза, если изменения происходят в системе репарации ДНК [1].
Существует несколько типов гибели клеток под воздействием ионизирующего излучения [2, 3], из которых наибольший интерес в контексте радиотерапии представляет апоптоз — запрограммированная гибель клеток, усиливаемая излучением, не оказывающая при этом губительного воздействия на окружающие ткани и не вызывающая воспаления [4]. Некоторые типы клеток устойчивы к индуцируемому радиацией апоптозу, другие — могут изменять свою чувствительность в зависимости от стадии клеточного цикла и микроокружения [5]. В настоящее время ведется достаточно большое количество исследований по поиску путей контроля апоптотической активности некоторых типов клеток в ответ на радио- или химиотерапию злокачественных опухолей [6, 7].
Доказано, что многие противоопухолевые препараты способствуют росту апоптотической активности в новообразованиях, но не обладают избирательным действием и, следовательно, повреждают и нормальные ткани [8]. Недостатки лучевой терапии — образование некрозов в опухоли, а также губительное воздействие радиации на окружающие здоровые клетки. Имеются данные, что ионизирующее излучение стимулирует апоптоз тимоцитов, лимфоцитов, многих клеток-предшественников. Зрелые дифференцированные клетки редко уходят в апоптоз под действием излучения, но есть данные о вызванном радиацией апоптозе клеток молочной железы, кишечных крипт и миндалин у человека. В эксперименте был также индуцирован апоптоз мышиных яйцеклеток и клеток гепатоцеллюлярной карциномы [9].
Сильноточные импульсные ускорители электронов, работающие в режиме генерации высокоинтенсивного тормозного излучения, в настоящее время являются инструментами научных исследований, направленных на разработку новых радиационных технологий. В испытаниях были определены некоторые их недостатки, ограничивающие использование в медицине, например нестабильность параметров от импульса к импульсу. В то же время более узкий пучок излучения должен минимизировать влияние на окружающие ткани, а высокая интенсивность воздействия — увеличить повреждающий эффект на зону облучения [10]. Применяемые в клинической практике гамма-установки при терапевтической мощности дозы 1,5–2 Гр/мин обеспечивают поглощение клеткой размером ~10 мкм в среднем 100 квантов/с с энергией около 1 МэВ. Паузы между актами лучевого воздействия составляют 1–10 мс, в то время как репарационные процессы в клетке идут быстрее и устраняют повреждения. Значительное увеличение интенсивности облучения, достижимое на современных сильноточных ускорителях пучков релятивистских электронов мощностью 1–100 ГВт, способно сократить время между актами облучения на 6–7 порядков, что должно (или может) привести к изменению реакции клетки на облучение. Опубликованные работы в области исследования влияния высокоинтенсивного радиационного излучения на биологические объекты противоречивы [11, 12, 13, 14, 15].
Целью исследования являлось определение биологических эффектов, вызываемых воздействием излучения высокой мощности экспериментальных установок «Ангара-5-1» и «Мир-М» на лимфоциты периферической крови человека, и их сравнение с эффектами, вызываемыми излучением низкой мощности терапевтической установки «Рокус-АМ».
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Исследование включало следующие этапы:
- приготовление суспензии мононуклеарных клеток крови человека,
- облучение полученных образцов с использованием терапевтического аппарата «Рокус-АМ» и установок высокоинтенсивного тормозного излучения «Ангара-5-1» и «Мир-М»,
- определение в образцах доли клеток, вступивших в апоптоз, методом проточной цитофлуориметрии.
Приготовление суспензии мононуклеарных клеток крови человека
Использовали суспензии нормальных лимфоцитов, выделенных из крови условно здоровых доноров. Кровь, отобранную в объеме 2,6 мл в пробирки с натриевой солью ЭДТА в качестве антикоагулянта, разводили фосфатно-солевым буфером (ФСБ) в соотношении 1 : 2 и наслаивали на фиколл плотностью 1,077 («ПанЭко», Россия). Образцы центрифугировали в течение 40 мин при 400 g. Слой мононуклеаров, содержавший 70–90 % лимфоцитов, отбирали с поверхности раздела, дважды отмывали ФСБ в течение 5 мин при 200 g и переводили в среду RPMI 1640, содержавшую 10 % эмбриональной телячьей сыворотки.
Полученную суспензию мононуклеаров крови делили на аликвоты для последующего облучения. Всего каждый образец делили на 12 проб: 2 пробы являлись контрольными, необлученными, а 10 подвергали облучению 5 различными дозами, попарно. Далее облученные образцы инкубировали в CO2-инкубаторе при 37 oС и 5 % CO2. Для одного образца из каждой пары время инкубации составляло 24 ч, для другого — 48 ч. Выбранные временные интервалы позволяют объективно определить уровень радиоиндуцированного апоптоза. С момента получения крови и до помещения образцов в CO2-инкубатор все работы проводили при комнатной температуре в течение 3,5–4 ч.
Облучение образцов на установке «Ангара-5-1»
Источником высокоинтенсивного тормозного излучения в этой установке служат 8 независимых генераторов сверхвысокой электрической мощности [8]. Все модули срабатывают одновременно: среднеквадратичное отклонение по параметру составляет всего 10 нс. Максимальное напряжение на согласованной нагрузке — 1,5 мВ. Форма импульса напряжения представляет собой полусинусоиду с длительностью импульса на полувысоте амплитуды 40–70 нс. Анодом служит танталовая фольга толщиной 50 мкм (рис. 1).
Анализ спектрального состава тормозного излучения показал, что основная энергия квантов находится в диапазоне 200–600 кэВ. Анализ проводили по профилям сигналов алмазных рентгеновских дозиметров типа АД3 (ВНИИА, Россия) с различными фильтрами.
Непосредственно дозиметрию осуществляли термолюминесцентными дозиметрами (ТЛД) типа ДПГ-03 (НПП «Доза», Россия), в состав которого входят 3 поликристаллических детектора на основе бората магния. Величину дозы определяли прибором КДТ-02М («Концерн-Электрон», Украина). По результатам прямой дозиметрии была экспериментально оценена зависимость дозы от расстояния объекта до диодов, на основании которой была рассчитана неоднородность дозы в зависимости от положения облучаемого образца. Расчеты показали, что на 1 см образца доза падает приблизительно на 10 % в вертикальном направлении и на 9 % — в горизонтальном относительно центра передней поверхности объекта. Были определены желательные места расположения образцов на фланце установки. Образцы помещали в цилиндрический дюралевый контейнер с толщиной дна и стенок 7 мм. Дно контейнера располагалось на расстоянии 57 мм от танталовой фольги.
Подведение различных доз к образцам достигалось расположением их на разном расстоянии от источников облучения. Максимальная доза варьировала от выстрела к выстрелу, поэтому рядом с образцами устанавливали дозиметры ТЛД. Одновременно с величиной дозы варьировала и ее мощность, т. к. продолжительность импульса при этом не менялась. При максимальной дозе (порядка 10 Гр) ее мощность превышала 100 МГр/с, при минимальной (менее 1 Гр) составляла около 10 МГр/с.
Для облучения образцы суспензии мононуклеаров помещали в пластиковые пробирки, располагаемые перпендикулярно относительно пучка излучения рис. 2, В. Толщина слоя жидкости в пробирках составляла около 4 мм. После облучения образцы переносили в культуральные чашки и помещали в CO2-инкубатор, как было описано выше.
Облучение образцов на установке «Мир-М»
Установка «Мир-М» — экспериментальная установка, сильноточный наносекундный ускоритель электронов. Выходная энергия — до 800 кВ, длительность импульса — 40–60 нс на полувысоте. Мишень анодного узла представляет собой танталовую фольгу толщиной 50–100 мкм.
Непосредственно за фольгой установлен дополнительный фильтр — углеродный композит Graflex толщиной 0,5–1 мм для поглощения прошедших через фольгу электронов. Фланец выпускного окна выполнен из алюминия толщиной 1 мм. Мощность доз совпадала с той, что получали при использовании установки «Ангара-5-1».
Дозиметрические измерения производили двумя способами.
Для оперативной дозиметрии использовали термолюминесцентные дозиметры ДТГ-4 (НПП «Доза»), представляющие собой монокристаллическую таблетку из фтористого лития, активированную магнием и титаном. Измерения облученных ТЛД производили на комплексе «ДОЗА-ТЛД» (НПП «Доза») с помощью программного обеспечения DVG того же производителя. Предел допустимой основной относительной погрешности системы ТЛД– комплекс «ДОЗА-ТЛД» (при доверительной вероятности 0,95) фотонного излучения составляет ± 30 %. Поэтому для повышения точности измерений дозиметры были дополнительно откалиброваны путем облучения на установке «Рокус-АМ» с источником излучения кобальт-60 в дозе 7 Гр с последующим измерением и учетом индивидуальных особенностей каждой таблетки ТЛД.
Для более точной дозиметрии использовали дозиметрические пленки Gafchromic EBT 2 (Ashland, США). Для обработки пленок использовали программу DoseLab 6.5 (Moebius Medical Systems, США). Ввиду того, что градиент дозы по оси пучка для установки «Мир-М» значителен и наблюдалось снижение дозы в 1,5–2 раза при прохождении 1 см объекта, в зависимости от используемого катода, при облучении стремились максимально уменьшить линейные размеры образца.
Образцы представляли собой 0,6 мл перемешанной суспензии мононуклеаров, герметизированной в гнезде диаметром 16 мм и глубиной 2 мм. Суспензия занимала весь объем гнезда, т. е. во время облучения лейкоциты были равномерно распределены в нем.
Пакет для облучения одного образца имел следующий состав: разделитель толщиной 5 мм из 2 пластиковых пластин толщиной 1 мм и промежутком между ними в 3 мм; слой пенополиуретана толщиной 2 мм с гнездом, содержащим образец; подложка в виде пластиковой пластины толщиной 1 мм. Пакеты размещались по одной оси так, что гнезда с образцами находились строго друг за другом. Таким образом, расстояние между образцами, если считать от центра, составило 8 мм. Расстояние от фланца установки до фронтальной границы первого образца составило около 1 см. Дозиметры располагали после разделителя, прилегая непосредственно к передней поверхности гнезда с образцом (рис. 2, А, Б).
Облучение образцов на терапевтической гамма-установке «Рокус-АМ»
«Рокус-АМ» представляет собой терапевтическую гамма-установку. Источником излучения служит кобальт-60. В исследовании ее использовали для сравнения эффективности излучения малой мощности и высокоинтенсивного гамма-излучения. Мощность дозы применявшейся установки составляла 0,9 Гр/мин (15 МГр/с), т. е. в 109–1010 раз уступала мощности наносекундных ускорителей.
Для облучения использовали ту же клеточную суспензию, что и на установках высокоинтенсивного гамма-излучения. Это позволило нивелировать различия, связанные с индивидуальными особенностями образцов.
Облучение проводили в одиночном гнезде из набора, использованного при облучении на установке «Мир-М». Горизонтальное расположение образца позволило использовать открытый тонкостенный пластиковый контейнер, занимавший весь объем гнезда и имевший высоту стенок 2 мм (рис. 2, Г). В связи с необходимостью достижения расчетной дозы установления электронного равновесия в зоне образца сверху помещали пластиковую пластину толщиной 5 мм, а под образцом — плексигласовую пластину толщиной 15 мм.
Параметры облучения: расстояние источник–поверхность — 75 см, поле — 10 × 10 см. Облучение производили со смещением по времени в 1–1,5 ч относительно времени облучения на установках высокоинтенсивного гамма-излучения.
Исследование уровня апоптоза в образцах
По завершении инкубации исследовали уровень апоптоза в образцах клеточной суспензии методом проточной цитофлуориметрии. Использовали две методики: окраску нативных образцов с помощью набора Annexin V-FITC Kit (Beckman Coulter, США), содержащим аннексин V и йодид пропидия, и окраску фиксированных образцов йодидом пропидия.
В первом случае после облучения и инкубации образцы отмывали в ФСБ и проводили окрашивание 100 мкл клеточной суспезии, содержавшей 106 клеток, согласно инструкции к набору Annexin V-FITC Kit. Данная методика окраски позволяет определить количество клеток, вступивших в апоптоз (аннексин V-положительные частицы); количество клеток, погибших/гибнущих по пути некроза (частицы, положительные по йодиду пропидия); оценить «ранний» апоптоз (частицы, положительные только по аннексину V) и «поздний» апоптоз (частицы, положительные и по аннексину V, и по йодиду пропидия).
Окраска фиксированных образцов йодидом пропидия выявляет апоптоз в виде «субдиплоидного» пика на однопараметрической гистограмме и отражает количество апоптотических телец в образце. Фиксацию проводили в 70 % ледяном этаноле после инкубации облученных образцов в течение 24 или 48 ч. Время фиксации составляло 72 ч. Далее клетки дважды отмывали в 1 мл ФСБ и ресуспендировали 100 мкл ФСБ. Для предотвращения связывания йодида пропидия с РНК исследуемую клеточную суспензию инкубировали с 20 мкл РНКазы А (R4875, Sigma-Aldrich, США) при 37 °С в течение 30 мин. По окончании инкубации суспензию окрашивали 20 мкл йодида пропидия в течение 40 мин при комнатной температуре в защищенном от света месте. Перед анализом на проточном цитофлуориметре в образец вносили 1 мл ФСБ. Конечная концентрация клеток составляла не менее 106 клеток.
Анализ проводили на проточном цитофлуориметре Cytomics FC 500 (Beckman Coulter). Измеряли отношение субдиплоидного пика к общему количеству клеток.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
При облучении лимфоцитов с помощью терапевтического гамма-аппарата «Рокус-АМ» установили, что зависимость уровня апоптоза от дозы облучения (в исследованном диапазоне доз) имеет линейный характер. При этом уровень апоптоза возрастает при увеличении времени инкубации после облучения: если через 24 ч инкубации уровень апоптоза под воздействием дозы в 5 Гр увеличивался примерно на 8,0 ± 2,2 % относительно условного 0 % в необлученных образцах, то через 48 ч инкубации наблюдалось увеличение уровня спонтанного апоптоза на 10,0 ± 2,6 %, а уровня апоптоза под воздействием дозы в 5 Гр — на 27,0 ± 3,8 % (p = 0,004) (рис. 3).
При облучении лимфоцитов с помощью установки «Ангара-5-1» уровень апоптоза также имел линейную зависимость от дозы, однако наклон прямой был существенно выше по сравнению с наклоном прямой, построенной для результатов облучения на аппарате «Рокус-АМ» (рис. 3). Так, если при воздействии дозой в 3 Гр на «Рокус-АМ» уровень апоптоза через 48 ч инкубации составил 23,0 ± 3,1 %, то при воздействии высокоинтенсивным излучением в дозе, сопоставимой с 3 Гр, уровень апоптоза в образце того же донора приближался к 31,0 ± 3,8 % (p = 0,050). Таким образом, высокоинтенсивное тормозное излучение оказывает больший проапоптотический эффект, чем гамма-излучение в дозах «терапевтической» мощности.
Поскольку различия, полученные при сравнительном исследовании влияния излучения двух типов на индукцию апоптоза лимфоцитов периферической крови, оказались достоверными мы продолжили работу на экспериментальной установке «Мир-М», разработанной специально для проведения медико-биологических экспериментов, для более глубокого понимания влияния высокоинтенсивного излучения на индукцию апоптоза. Для этого использовали маркеры раннего и позднего апоптоза и выделили фракцию некротических клеток, ранее не исследованную, т. к. эти клетки при регистрации субдиплоидного пика попадают во фракцию неповрежденных клеток.
На рис. 4 показаны изменения уровня апоптоза (ранний —рис. 4, А и поздний —рис. 4, Б) и уровня некроза в облученных образцах (рис. 4, В), а также суммарная клеточная гибель (рис. 4, Г) в зависимости от дозы облучения и мощности установки. Провели сравнение воздействия гамма-излучения терапевтической установки «Рокус-АМ» и высокоинтенсивного излучения экспериментальной установки «Мир-М» (только для продолжительности инкубации образцов лимфоцитов в 48 ч).
Показано, что суммарная клеточная гибель примерно одинакова при работе с обеими установками, а при дозе облучения более 5 Гр наблюдается тенденция к увеличению клеточной гибели при облучении на установке «Рокус-АМ» (рис. 4, Г). Однако при сравнении типов клеточной гибели уровень апоптоза (количество аннексин V-положительных клеток) достоверно выше (р < 0,05) при воздействии на периферические лимфоциты высокоинтенсивного излучения установки «Мир-М» в дозах от 4 Гр. Уровень некроза при воздействии установкой «Мир-М» не превышал 12,0 ± 2,2 % (доза 6 Гр), а при воздействии гамма-установкой «Рокус-АМ» — 44,0 ± 8,1 % (доза 6 Гр) (р = 0,0029).
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
В силу того, что экспериментальные установки «Ангара-5-1» и «Мир-М» являются уникальными, не имеющими аналогов в мире, сравнение результатов данного исследования с результатами других авторов затруднено. Есть несколько работ, посвященных исследованию биологических эффектов при использовании фотонного пучка ультравысокой мощности [6, 7, 16], и в этих работах не анализируются варианты гибели клеток при воздействии гамма-излучением сверхвысокой мощности, а только приводятся данные об общей гибели клеток или сопоставляется противоопухолевая активность на животных.
Исследование зависимости индукции апоптоза лимфоцитов периферической крови здоровых доноров с использованием высокоинтенсивного тормозного излучения на установках «Ангара-5-1» и «Мир-М» в сравнении с гамма-излучением установки «Рокус-АМ» показало, что использование высокоинтенсивного излучения приводит к усилению индукции апоптоза. При этом рост уровня апоптоза линейный в диапазоне доз до 6 Гр и зависит от продолжительности инкубации после облучения (24 или 48 ч). В то же время имеются данные об отсутствии различий по уровню апоптоза при облучении дозами разной мощности [16]. Так, в работе Kotenko и соавт. показано, что при увеличении мощности дозы происходит рост числа двунитевых разрывов ДНК и нарушение механизмов репарации ДНК, но уровень апоптоза при этом не меняется. Аналогичные результаты получены в работе [17]. Но, хотя в этих исследованиях и изучали терапевтические диапазоны доз, возникает вопрос: почему нарушения репарации ДНК в сочетании с высоким уровнем двунитевых разрывов не приводили к усилению апоптотических процессов? Возможно, различия между нашим исследованием и этими работами объясняются особенностями биологических моделей. Так, если мы облучали мононуклеары периферической крови, то в исследованиях[16, 17] облучали фибробласты человека. К тому же облучение на установках «Ангара-5-1» и «Мир-М» отличается максимально высокой мощностью, порядка 100 МГр/с, что также может существенно влиять на результаты. И, возможно, при достижении таких мощностей доз перестают работать дополнительные системы репарации ДНК, которые проявляют активность при дозах 1–400 мГр/мин (0,017–6,7 МГр/с) [17]. Можно предположить, что в этом случае двунитевые разрывы ДНК имеют такую пространственную конфигурацию, что работа систем репарации оказывается затруднена (например, увеличивается «плотность» двойных разрывов). Следует также подчеркнуть, что радиочувствительность клетки зависит от фазы клеточного цикла и она минимальна для неделящихся клеток, к которым относятся мононуклеары периферической крови, большая часть которых — это лимфоциты. Именно неделящиеся клетки опухоли образуют наиболее радиорезистентную клеточную фракцию опухолевой клеточной популяции. Поэтому полученные нами результаты могут представлять определенный интерес для разработки методов лучевой терапии с использованием гамма-излучения, имеющего сврехвысокую мощность дозы.
Мы также обнаружили, что уровень некроза, индуцируемого высокоинтенсивным излучением, достоверно ниже такового, регистрируемого при использовании «терапевтического» гамма-излучения. При этом в диапазоне доз до 6 Гр уровень некроза возрастает пропорционально увеличению дозы. Анализ суммарной гибели клеток (лимфоцитов периферической крови) показал, что при использовании 2 мощностей дозы при однократном облучении в диапазоне доз до 6 Гр значение этого показателя примерно одинаково для установок разных типов. Перечисленные результаты согласуются с тем, что наблюдали другие исследователи. Например, в работе Brüchne и соавт. [9] эффект задержки роста опухолевого узла КНТ-C фибросаркомы мышей был сопоставим при облучении на терапевтической гамма-установке и экспериментальной установке лазерного высокоинтенсивного излучения.
ВЫВОДЫ
В диапазоне доз до 6 Гр уровень суммарной клеточной гибели при воздействии высокоинтенсивным гамма-излучением сопоставим с таковым при воздействии гамма-излучением терапевтической установки. При этом высокоинтенсивное излучение индуцирует клеточную гибель по пути апоптоза, в то время как низкоинтенсивное — по пути некроза.
Полученные нами результаты позволяют предположить, что высокоинтенсивное излучение может быть предпочтительнее низкоинтенсивного в клинической (онкологической) практике, т. к. индукция гибели значительной доли клеток по пути именно апоптоза более «физиологична» и должна реже приводить к осложнениям, связанным с массовой некротической гибелью клеток (распад тканей, интоксикация, повреждение нормальных тканей и др.). Необходимы эксперименты по исследованию механизмов активации апоптоза в неделящихся (интерфазных) клетках при использовании сверхвысоких мощностей дозы, в том числе в сравнении с клетками, находящихся в других фазах клеточного цикла.