Ишемический инсульт головного мозга является одним из наиболее серьезных неврологических нарушений, занимающим второе место после сердечно-сосудистых заболеваний в структуре причин смертности и инвалидизации населения по всему миру [1, 2, 3, 4]. На сегодняшний день не существует эффективной стратегии лечения этого заболевания, малоизученным остается и его патогенез.

К настоящему времени разработано несколько разных моделей ишемического инсульта [5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12], однако окклюзия средней мозговой артерии с помощью введения внутрь сосуда окклюдера (монофиламента) является наиболее популярной. Впервые эту модель описали Koizumi и соавт. [13], но с тех пор она была усовершенствована и сейчас адаптирована для различных лабораторных животных, например, для крыс [14] и мышей [15].

Помимо разных животных и разных моделей ишемического инсульта используют также разные способы визуализации поврежденной области мозга. Инфаркт можно выявить на срезах мозга, используя гистологические красители: самым распространенным подходом является окраска гематоксилин-эозином [16, 17], применяют и различные модификации окраски по методу Ниссля [18, 19]. Также существует способ импрегнации нервных тканей серебром. В некоторых работах отмечено, что такой подход позволяет зафиксировать дегенеративные процессы на более ранних стадиях патогенеза [20, 21]. Альтернативным подходом может быть использование флуоресцентных красок Fluoro-Jade [22, 23, 24], однако точный механизм действия этих красок пока неизвестен. Одним из самых простых способов визуализации поврежденной ткани на срезах мозга является ее окрашивание c помощью 2,3,5-трифенилтетразолия хлористого (ТТХ) [25]. В живых клетках ферменты c дегидрогеназной активноcтью восстанавливают это соединение до производного формазана, который дает стабильное красное окрашивание здоровой ткани. В поврежденных областях, в которых нет функциональной активности митохондрий, окрашивания не происходит. Еще один подход основан на применении методов иммуногистохимии, которые позволяют визуализировать, например, апоптотические клетки в зоне поражения [26, 27]. К неинвазивным методам региcтрации инсульта относятся магнитно-резонансная томография [28], позитронно-эмиссионная томография [29] и однофотонная эмиссионная компьютерная томография [30]. Это далеко не весь перечень подходов, с помощью которых можно визуализировать ишемический очаг повреждения, более подробная информация представлена в тематических обзорах [31].

Из-за разнообразия подходов к исследованию патогенеза инсульта и разработки методов его терапии в рамках регулярных конференций «Практические и фундаментальные проблемы терапии инсульта» (The Stroke Therapy Academic Industry Roundtable, STAIR) было выпущено множество рекомендаций, касающихся важных аспектов экспериментального моделирования ишемического инсульта [32, 33, 34, 35]. Согласно им результат исследования во многом зависит от выбора экспериментальной модели, линии животного, типа анестезии, способа визуализации повреждения мозга и других параметров.

При этом во многих исследованиях даже протоколы стандартных процедур могут существенно различаться. Например, способ визуализации поврежденной ткани на срезах мозга с помощью ТТХ используется в большинстве современных исследований. В оригинальной статье срезы мозга крысы спустя 24 ч с момента начала окклюзии прокрашивали в растворе ТТХ в течение 30 мин при 37 °С [25]. Однако в ряде работ зафиксировать повреждение мозга с помощью этого подхода удалось уже через несколько часов с момента окклюзии [21, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43]. Кроме того, в разных работах варьируют длительность инкубации срезов мозга в растворе ТТХ от 5 мин [44] до общепринятых 30 мин [25]. В некоторых протоколах утверждается, что ТТХ нестабилен при нагревании, поэтому окрашивание ткани рекомендуют проводить при комнатной температуре [45]. В большинстве работ окрашивают срезы мозга, но в некоторых случаях животным проводят транскардиальную перфузию раствором ТТХ [38, 46].

В настоящей работе мы показали, что температура и время инкубации срезов мозга в растворе ТТХ значительно влияют на визуализацию поврежденной ткани мозга крыс в острой фазе перманентной ишемии, что может приводить к неверной интерпретации результатов экспериментов. Мы также продемонстрировали, что выбор используемой анестезии животного существенно влияет на степень ишемического повреждения на ранней стадии развития патологии (5 ч после окклюзии), в то время как на более поздних этапах (24 ч после окклюзии) это влияние нивелируется.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эксперименты с животными выполняли в соответствии с требованиями Директивы 2010/63/EU Европейского парламента и совета Европейского союза от 22.09.2010. Протокол исследования был утвержден комиссией ИБХ РАН по контролю за содержанием и использованием животных.

Работу проводили на самцах крыс линии Wistar из питомника лабораторных животных «Пущино» весом от 280 до 330 г. Крыс содержали в виварии ИБХ РАН по 3 особи в пластмассовых клетках со свободным доступом к воде и пище.

Окклюзию средней мозговой артерии проводили по протоколу [14]. В работе использовали три вида анестезии:

1. изофлуран (Аерран, Baxter, США): введение в наркоз — 5 %, поддержание наркоза — 1,5 %;
2. тилетамина гидрохлорид/золазепама гидрохлорид (Золетил, Virbac Sante Animale, Франция; 40 мг/кг) + ксилазина гидрохлорид (Рометар, Bioveta, Чехия; 10 мг/кг) — внутрибрюшинная инъекция;
3. хлоралгидрат («Диаэм», Россия; 400 мг/кг).

Для обезболивания использовали кетопрофен (Ketonal, Sandoz, Швейцария; 5 мг/кг подкожно), местное обезболивание проводили с помощью 2 % новокаина.

В работе использовали готовые окклюдеры фирмы Doccol (США) диаметром 0,185 мм, кат. № 403756PK10Re. Через заданные промежутки времени крыс декапитировали, мозг вынимали и резали на фронтальные срезы толщиной 2 мм. Срезы помещали в 1 % раствор ТТХ (Sigma-Aldrich, США). Окраску проводили при комнатной температуре (20 °С) и при 37 °С.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для того чтобы оценить, как разные условия прокраски тканей мозга с помощью красителя ТТХ влияют на визуализацию ишемического повреждения, мы использовали модель окклюзии средней мозговой артерии крыс [14]. В работе использовали перманентную окклюзию, т. е. сосуд перекрывался окклюдером на все время эксперимента. Животных вводили в наркоз внутрибрюшинной инъекцией смесью препаратов Золетил и Рометар. Через 5 ч с момента окклюзии мозг каждого животного извлекали и получали фронтальные срезы толщиной 2 мм. Далее часть срезов помещали в 1 % раствор ТТХ при комнатной температуре, а часть — в заранее подогретый до 37 °С в инкубаторе раствор. Через равные временные промежутки мы фотографировали срезы мозга и оценивали, как температура и длительность инкубации срезов в растворе красителя влияет на визуализацию поврежденной ткани. Через 10 мин при обеих температурах, при которых проводилось окрашивание, можно было визуализировать область повреждения: она отличалась более слабым прокрашиванием по сравнению со здоровыми тканями среза (рис. 1). При дальнейшей инкубации срезов в растворе красителя более интенсивно окраска развивалась при 37 °С, при этом уже через 20 мин инкубации контраст между здоровой и поврежденной тканью существенно снизился, поскольку поврежденная область также прокрашивалась в промежуточный розовый цвет. При комнатной температуре контраст между поврежденной и неповрежденными областями, наоборот, усилился. При более длительной инкубации всех срезов при температуре 37 °С поврежденная область практически полностью прокрасилась (рис. 1). Следует подчеркнуть, что условия прокрашивания срезов мозга с помощью ТТХ наиболее важно контролировать именно при небольших интервалах времени с момента окклюзии сосуда, поскольку в поврежденной ткани еще могут присутствовать живые клетки, влияющие на развитие окрашивания. Через 24 ч после окклюзии область повреждения отчетливо визуализировалась с помощью ТТХ, при этом контраст с окрашенной здоровой тканью в дальнейшем не изменялся даже после двухчасовой инкубации при 37 °С.