Рак молочной железы (РМЖ) является вторым по распространенности типом рака в мире, занимает первое место в структуре онкологической заболеваемости и второе — в структуре смертности среди женщин [1]. Заболеваемость РМЖ увеличивается с возрастом и особенно велика среди женщин 60–65 лет, при этом патология зачастую диагностируется на поздних стадиях, что и определяет высокий уровень смертности от нее. Наибольшую опасность представляет собой метастазирующий РМЖ, который крайне трудно поддается лечению, несмотря на применение комбинированных схем, включающих химио- и гормонотерапию, а также использование таргетных противоопухолевых препаратов. Общий уровень 5-летней выживаемости пациентов при РМЖ составляет 55 %. В этой связи представляется актуальной разработка подходов для более эффективного скрининга РМЖ и выбора средств для таргетной терапии, учитывающих молекулярно-генетические особенности опухолей.

Стремительное развитие технологий высокопроизводительного секвенирования (next-generation sequencing, NGS) привело к получению большого количества данных о генетических вариантах [2]. Идентифицировано множество мутаций, связанных с развитием РМЖ, в том числе соматические и герминальные мутации в генах PIK3CA, STK11/LKB1, CDH1, ATM, CHEK2, BRIP1, PALB2, а также мутации в высокопенетрантных генах TP53, PTEN, MLH1, BRCA1, BRCA2, ассоциированных с наследственными формами РМЖ [3].

Большинство мутаций, возникающих в опухолях, являются соматическими и играют важную роль в патогенезе онкологических заболеваний и развитии de novo резистентности к лекарственным препаратам. Поэтому многие исследования направлены на профилирование вариантов в образцах опухолей с применением NGS. В результате было идентифицировано значительное количество вариантов с неизвестной функцией. Для их описания необходимы математические алгоритмы, позволяющие обрабатывать большие массивы данных в автоматическом режиме, предсказывать потенциально патогенные мутации и отличать их от нейтральных изменений генома опухолевых клеток. Результаты подобных исследований могут быть использованы для разработки скрининговых и диагностических инструментов (включая технологии жидкостной биопсии), а также инструментов подбора таргетных противоопухолевых препаратов.

В настоящей работе представлены результаты анализа спектра мутаций в составе ключевых онкогенов при РМЖ с применением метода высокопроизводительного секвенирования и ранее разработанного биоинформатического алгоритма для функциональной аннотации мутаций и оценки их патогенности.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Для проведения исследования были получены образцы опухолей от 16 пациенток со злокачественными новообразованиями молочной железы в возрасте от 27 до 76 лет (средний возраст — 50,7 ± 11,3 года), проходивших комплексное обследование и получавших комбинирование лечение в Национальном медицинском исследовательском центре онкологии имени Н. Н. Блохина (Москва). Критериями включения в исследование были: возраст 18–70 лет, женский пол, наличие гистологически и цитологически подтвержденного диагноза «рак молочной железы». Критериями исключения являлись наличие других форм новообразований в анамнезе и беременность.

Стадию опухолевого процесса устанавливали согласно классификации TNM [4]. В исследование были включены пациентки со стадиями T1–3N0–3M0–1.

Работа была выполнена с соблюдением принципов добровольности и конфиденциальности. От всех пациентов были получены письменные информированные согласия на проведение исследования. Клиническая характеристика больных представлена в табл. 1.

Выделение ДНК и контроль качества

Выделение ДНК из образцов опухолевой ткани проводили с применением набора DNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen, США). Измельченные образцы опухолевой ткани после добавления буфера ATL обрабатывали протеиназой K и инкубировали при 56 °C до полного лизиса. Затем обрабатывали ферментом РНКазой А. Далее последовательно добавляли 200 мкл буфера AL и 96 % этанола. Полученную смесь переносили на спин-колонки и центрифугировали при 8 000 g в течение 1 мин. Затем образцы промывали с применением буферов AW1 и AW2 для удаления солей (гуанидина и SDS). Для элюции ДНК колонки обрабатывали буфером 1x Low-TE (дважды, по 30 мкл), затем инкубировали и центрифугировали согласно протоколу производителя. Контроль качества полученной ДНК проводили на флуориметре Qubit 3.0 (Thermo Fisher Scientific, США), а также с помощью электрофореза в 1 % агарозном геле с добавлением бромистого этидия.

Секвенирование таргетной панели онкогенов

Из образцов ДНК опухолей молочной железы готовили библиотеки с применением набора реагентов NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina (New England Biolabs, США). Двойное баркодирование библиотек проводили с помощью ПЦР с применением наборов реагентов NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina и NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Dual Index Primers Set 1, New England Biolabs). Контроль качества полученных библиотек фрагментов ДНК проводили на приборе Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, США) с помощью набора реагентов этого же производителя High Sensitivity Kit в соответствии с протоколом производителя.

Для таргетного обогащения кодирующих регионов геномов опухолей использовали набор MYbaits Onconome KL v1.5 Panel (MYcroarray, США). Анализ проводили с применением системы высокопроизводительного секвенирования HiSeq 2500 (Illumina, США) методом парных прочтений длиной 100 нуклеотидов. Подготовку образцов и запуск секвенирования осуществляли согласно стандартным протоколам Illumina.

Биоинформатическая обработка данных

Для биоинформатической обработки полученных при секвенировании NGS-данных применяли ранее разработанный алгоритм [5]. На начальном этапе проводили оценку качества прочтений, полученных при секвенировании ДНК опухолей: последовательности, имевшие качество прочтения ниже 10, удаляли с помощью программного обеспечения Cutadapt [6]. После этого прочтения картировали на референсный геном hg19 (GRCh37.p13) с помощью алгоритма BWA (Burrows–Wheeler Aligner) [7]. ПЦР-дубликаты удаляли специализированной командой rmdup в составе программной платформы SAMtools [8].