Одной из современных проблем здравоохранения является стремительное увеличение количества штаммов бактерий, устойчивых к существующим антибактериальным средствам. Некоторые из них выработали резистентность даже к наиболее эффективным в настоящее время препаратам и препаратам резерва. Все больше штаммов приобретают множественную или широкую лекарственную устойчивость. В отдельных случаях выявляются «супербаги», не восприимчивые ни к одному применяемому для данной инфекции антибиотику. Быстрое появление и распространение разнообразных механизмов устойчивости к антибактериальным средствам обусловливает необходимость разработки принципиально новых подходов борьбы с бактериями. В краткосрочной перспективе существенным представляется повышение эффективности использования известных антибиотиков, например, с помощью разработки усовершенствованных подходов к терапии. В долгосрочной перспективе необходима разработка антибактериальных средств, для которых развитие устойчивости будет маловероятным.
Одной из альтернатив антибиотикам и синтетическим антибактериальным средствам являются бактериофаги. Уже много лет они используются для борьбы с инфекциями, вызванными различными возбудителями [1, 2]. Применение бактериофагов имеет множество преимуществ: автоматическое дозирование в зависимости от степени заражения, минимальное нарушение естественной микрофлоры, низкая вероятность развития устойчивости, совместимость с антибиотиками, быстрая скорость разработки средств на основе фагов и их низкая стоимость, уничтожение биопленок, возможность единоразового введения и применения низких доз, а также низкая степень нагрузки на окружающую среду [3]. Однако есть и недостатки применения таких лекарственных препаратов. Работа с бактериофагами трудоемка — их сложно выделять из бактериальных культур с требуемой степенью чистоты, необходимо постоянно определять и нормировать их фармакокинетические характеристики, меняющиеся в процессе хранения. Между тем культивирование необходимо проводить на близких к патогену видах и штаммах, для которых отсутствуют эффективные стандартные протоколы культивирования и применяются высокие требования к безопасности в работе. К тому же, бактериофаги могут переносить гены бактериальных токсинов, а появление к ним устойчивости все же вероятно. И, наконец, фаги в высокой степени иммуногенны, что впоследствии снижает эффективность их повторного применения [3 – 5].

Новым классом антибактериальных агентов, которому не присущи вышеуказанные минусы, являются фаголизины (эндолизины). Фаголизины — это кодируемые бактериофагами специфические ферменты, расщепляющие пептидогликан клеточной стенки бактерий. В ходе своего жизненного цикла бактериофаги выделяют фаголизины для проникновения в клетку фаговой ДНК при инфицировании бактерий, а также для высвобождения новых вирионов из клетки. За счет действия своих каталитических доменов фаголизины способствуют расщеплению различных связей в пептидогликане. Гибель бактерии происходит вследствие гипотонического лизиса из-за различия в осмотическом давлении внутри и снаружи клетки [6].

Существует ряд неоспоримых преимуществ использования фаголизинов по отношению к другим антимикробным агентам. Во-первых, это селективность. Воздействуя на определенный вид бактерий, фаголизины не влияют на представителей нормальной микрофлоры организма. Во-вторых, фаголизины очень быстро действуют на пептидогликан клеточной стенки, не задействуя длительные метаболические процессы, что приводит к быстрому лизису бактерии. Время лечения таким препаратом может значительно снижаться по сравнению с терапией антибактериальными средствами. В-третьих, очень важным аспектом является низкая вероятность развития резистентности к фаголизинам. Фаголизины действуют на специфические молекулы-мишени, которые необходимы для нормальной жизнедеятельности клеток-хозяев, в связи с этим возникновение устойчивых изолятов маловероятно, поскольку должно сопровождаться коренной перестройкой бактериальной клеточной стенки. В-четвертых, фаголизины действуют на антибиотикоустойчивые штаммы бактерий, что решает одну из важнейших проблем здравоохранения. И, в-пятых, вследствие своей способности дестабилизировать пептидогликан клеточной стенки фаголизины способны не только уничтожать клетки бактерий, находящихся в различных метаболических состояниях (состоянии покоя или при активном делении), но и разрушать образуемые патогенами биопленки [7].

Одним из опаснейших возбудителей внутрибольничных инфекций является синегнойная палочка (Pseudomonas aeruginosa). Борьба с ней сильно затруднена в связи с ее стремительно растущей устойчивостью к антибиотикам, способностью образовывать биопленки, а также разнообразием видов инфекций, вызываемых ею [8]. Создание новых лекарственных средств с активностью против Pseudomonas aeruginosa становится особенно важным.

Бактериофаг КРР10 обладает широким спектром действия на различные штаммы Pseudomonas aeruginosa [9], в связи с чем его рекомбинантный фаголизин представляется перспективным белком для изучения физико- химических свойств и спектра литической активности, а также для создания на его основе антибактериального средства против Pseudomonas aeruginosa. В настоящей статье приводятся полученные нами данные по наработке рекомбинантного артилизина бактериофага КРР10, изучению его физико-химических свойств, а также бактерицидной активности.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Получение белков AL-KPP10 и L-KPP10

Последовательности генов, кодирующих белки эндолизин L-KPP10 и артилизин AL-KPP10, были получены с использованием коммерческого синтеза (Евроген, Россия) в составе вектора pAL2-T. Последовательность была проверена на отсутствие ошибок с использованием секвенирования по Сэнгеру. В дальнейшем синтезированный ген в векторе pAL2-T, кодирующий последовательность L-KPP10, был расщеплен эндонуклеазами рестрикции по сайтам BamH – SacI и BamHI – PstI соответственно. По тем же сайтам был расщеплен экспрессионный вектор pQE- 30. Полученные рестрикционные фрагменты разделяли с помощью электрофореза в агарозном геле и после визуализации в УФ-свете выделяли необходимые фрагменты с помощью специального набора «Silica Bead DNA Extraction Kit» (Thermo, США). Далее проводили лигирование соответствующих рестрикционных фрагментов вставки и вектора в стандартном лигазном буфере T4 лигазой (Thermo, США). Два полученных экспрессионных вектора pQE-30 (несущих гены AL-KPP10 и L-KPP10) помещали в компетентные клетки Escherichia coli штамма М15 с помощью трансформации методом «Heat Shock» для дальнейшей продукции белков. Для этого к компетентным клеткам добавляли полученные лигазные смеси, инкубировали в течение 25 мин на льду, затем нагревали при 42 °С в течение 45 с, помещали на лед на 2 мин, а затем добавляли среду LB, подращивали клетки при 37 °С в течение 1 ч и высевали на чашки Петри. После инкубации чашек Петри при 37 °С в течение ночи, полученные колонии высевали в жидкую среду LB с необходимыми антибиотиками. После наращивания клеток-продуцентов до OD600 = 0,6 и индукции в течение 3 ч с помощью добавления 1 мМ IPTG проводили очистку на колонке с Ni-NTA – агарозой. Для этого индуцированные клетки лизировали буфером, содержащим 6 М гидрохлорида гуанидина, 10 мМ Трис, 100 мМ NaH2PO4•H2O (рН 8,0) в течение 1 ч, а затем лизат, в котором находится целевой белок, наносили на колонку в режиме gravity flow. Белок элюировали с сорбента путем понижения pH в градиенте буферов (состоящем из 8 М мочевины, 10 мМ Трис, 0,1 М NaH2PO4•H2O, при рН от 8,0 до 5,5). Далее полученные фракции белков AL-KPP10 и L-KPP10 очищали с помощью аффинной хроматографии на колонке HisTrap HP (GE Healthcare, Великобритания). Раствор белка наносили на колонку в буфере, состоящем из 8 М мочевины, 10 мМ Трис, 0,1 М NaH2PO4•H2O, 10 мМ имидазола. Целевой белок элюировали с колонки с помощью буфера, содержащего 8 М мочевину, 10 мМ Трис, 100 мМ Na2HPO4 и 500 мМ имидазола (pH 5,5). Полученные фракции белков диализовали от буфера, в состав которого входят 5 мМ HEPES и 1 мМ DTT (pH 5,5) при 4 °С. Концентрацию белков измеряли спектрофотометрически на приборе HITACHI U-2900 (Hitachi, Япония) в кюветах с длиной пути 1 см. Измеряли оптическую плотность растворов белков при 280 нм. Концентрацию рассчитывали с учетом коэффициента поглощения E^0,1%₂₈₀ нм, равного 1,455 и рассчитанного с помощью приложения ProtParam [10].

Физико-химические методы измерения

1. Измерение спектров кругового дихроизма

Спектры кругового дихроизма рекомбинантных белков, полученных в денатурирующих условиях и диализованных от 0,1 М фосфатного буфера, измеряли на модифицированном дихрографе Jobin-Ivon Mark V (Horiba, Япония) при комнатной температуре в кюветах c длиной оптического пути 1 мм, при концентрациях белков около 200 мкг/мл. Область измерения спектров составила 190–260 нм.

2. Динамическое лазерное светорассеяние

Гидродинамический диаметр частиц в растворе определяли на приборе ZetaSizer Nano-ZS компании Malvern Instruments LTD (Malvern, США) при 25 °С в специальных полистироловых кюветах с длиной пути 1 см. Длина волны лазера составляла 633 нм. Использовали пробы белков, полученных в денатурирующих условиях согласно методике, описанной выше c последующим диализом. Концентрация проб белков была заранее измерена на спектрофотометре. Полученные данные были обработаны с помощью программы Dispersion Technology Software version 5.10 (Malvern, США).

3. Измерение спектров флуоресценции

Спектры триптофановой флуоресценции проб белков с известной концентрацией (40 мкг/мл), полученных в денатурирующих условиях и очищенных на хроматографе, снимали на флуориметре FluoroMax-3 производителя HORIBA Jobin Yvon GmbH (Horiba, США) при комнатной температуре в специальных кюветах с длиной оптического пути 1 см, при возбуждающей эмиссию длине волны (соответствующей поглощению трипотфана) равной 280 нм. Область измерения спектров составила 300–400 нм.

Изучение антибактериальных свойств

1. Изучение бактерицидной активности

Использовали препараты L-KPP10 и AL-KPP10, очищенные на хроматографической колонке и диализованные от буфера, содержащего 5 мМ HEPES и 1 мМ DTT (рН 5,5). Концентрацию белков доводили до необходимого значения тем же буфером.

Ночную культуру (2 мл в среде LB) бактериального штамма разбавляли и растили до оптической плотности OD600 = 0,6. Полученную культуру (2 мл) осаждали цен- трифугированием (3000 g, 10 мин), клетки ресуспендировали в таком же объеме 5 мМ HEPES (рН 5,5); мутность полученной суспензии должна соответствовать стандарту мутности по МакФарланду 0,5. Далее бактериальную культуру разбавляли в 100 раз таким же буфером (конечная плотность клеток составила 106 кл./мл). В 96-луночном планшете готовили следующие смеси:

1) 100 мкл суспензии бактерий, 50 мкл препарата в нужной концентрации и 50 мкл ЭДТА (конечная концентрация 0,5 мМ);

2) 100 мкл суспензии бактерий и 100 мкл препарата в нужной концентрации;

3) 100 мкл суспензии бактерий и 100 мкл буфера (контроль);

4) 100 мкл суспензии бактерий, 50 мкл буфера и 50 мкл ЭДТА (контроль).

Полученные смеси инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем делали 10-кратные разведения в фосфатном буфере (pH 7,2) и 100 мкл каждого разведения наносили на чашки Петри с агаризованной средой LB. Колонии на чашках подсчитывали после ночной инкубации при 37 °С.

В микробиологических исследованиях были задействованы штамм Pseudomonas aeruginosa РА103, а также клинические изоляты Ts 38–16, Ts 43–16, Ts 44–16, Ts 47–16, Ts 48–16 и Ts 49–16, депонированные в коллекции Национального исследовательского центра эпидемиологии и микробиологии имени Н. Ф. Гамалеи Минздрава России.

2. Электронная микроскопия

AL-KPP10 в концентрации 50 мкг/мл добавляли к 106 КОЕ чувствительного штамма Ts 43-16 в буфере HEPES и инкубировали в течение 10, 20 или 30 мин при комнатной температуре.

10 мкл смеси наносили на специальную сеточку, высушивали при комнатной температуре, затем окрашивали 1% раствором уранилацетата, помещая сеточку на 30 с в каплю красителя. Остаток уранилацетата убирали, отмывая сеточку в капле воды в течение 30 с, промакивали фильтровальной бумагой и высушивали при комнатной температуре. Полученные препараты просматривали на электронном микроскопе JEOL JEM-101 (FEI Phenom World, Голландия).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Получение и характеристика физико-химических свойств рекомбинантных молекул эндолизина и артилизина

В ходе работы были получены два рекомбинантных белка: эндолизин L-KPP10 и его модифицированный вариант — артилизин AL-KPP10, содержащий на С-конце своей структуры фрагмент миелоидного антимикробного пептида SMAP-29 ([K2,7,13]-SMAP-29(1–17)). Конструкции были получены с использованием коммерческого синтеза генов. Для получения экспрессионных конструкций оба варианта гена были перенесены в вектор pQE-30. Два полученных экспрессионных вектора (несущих гены AL-KPP10 и L-KPP10) помещали в компетентные клетки штамма М15 Esherichia coli с помощью трансформации методом «Heat Shock», наращивали клетки-продуценты и индуцировали продукцию белка с помощью добавления синтетического аналога лактозы ИПТГ (изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид). Далее клетки лизировали, полученные в денатурирующих условиях клеточные лизаты фракций белков AL-KPP10 и L-KPP10 очищали методом аффинной хроматографии с помощью гистидинового тага с N-концов белковых молекул и рефолдировали путем диализа.

На следующем этапе характеризовали различные физико-химические свойства полученных белков. Для определения структуры L-KPP10 и его модифицированного варианта AL-KPP10 проводили эксперименты в денатурирующих условиях и после ренатурации. В результате были исследованы: спектры кругового дихроизма для изучения вторичной структуры, спектры триптофановой флуоресценции для изучения наличия третичной структуры, а также динамическое лазерное светорассеяние белков для изучения их способности к агрегации/олигомеризации.

Изучение спектров кругового дихроизма показало, что AL-KPP10 и L-KPP10 имеют форму спектра, типичную для αβ-белков с некоторым вкладом неупорядоченных структур (рис. 1A). Присутствие в структуре AL-KPP10 пептида [K2,7,13]-SMAP-29(1–17) не влияет на вторичную структуру белка, так как спектры практически полностью совпадают.

При помощи изучения спектров триптофановой флуоресценции исследовали наличие третичной структуры белков (рис. 1Б). По сравнению с денатурированными белками, у ренатурированных белков наблюдается смещение максимумов эмиссии в более коротковолновую область. Это смещение свидетельствует об уменьшении числа контактов триптофана в составе внутреннего белкового кора с молекулами растворителя вследствие восстановления третичной структуры. Данный результат позволяет рассчитывать, что после ренатурации AL-KPP10 и L-KPP10 способны проявлять ферментативную активность. Для изучения стабильности растворов полученных рекомбинантных белков был применен метод динамического лазерного светорассеяния. Данный метод позволяет определить гидродинамический размер белкового комплекса в растворе и способность молекулы белка к агрегации. Небольшие размеры наблюдаемого комплекса (3–7 нм) свидетельствуют о том, что белок находится в виде мономеров, а такое состояние является показателем стабильности белков в растворе. В случае изучаемых эндолизинов динамическое лазерное светорассеяние показало, что большая часть белков в нативном состоянии находятся в виде агрегатов размером около 60 нм, что является нормой для рекомбинантных белков, полученных с использованием процедуры ренатурации (рис. 1В, рис. 1Г).

Противомикробная активность рекомбинантных молекул эндолизина и артилизина по отношению к Pseudomonas aeruginosa

Для изучения противомикробной активности рекомбинантных эндолизина и артилизина KPP10 использовали коллекцию лабораторных штаммов и клинических изолятов лаборатории трансляционной биомедицины Национального исследовательского центра эпидемиологии и микробиологии имени Н. Ф. Гамалеи Минздрава России. Для изучения бактерицидного эффекта заданное количество предварительно подготовленных клеток нужных штаммов Pseudomonas aeruginosa обрабатывали раствором с различными концентрациями рекомбинантных фаголизина и артилизина, после чего производили посев на плотную агаризованную среду LB.

В результате экспериментов было показано, что эндолизин L-KPP10 не обладает бактерицидным эффектом на коллекционный штамм РА103 в исследованных концентрациях (рис. 2А). Данный результат был ожидаем, так как наличие наружной мембраны не позволяет белку проникнуть к молекулярным мишеням клеточной стенки грамотрицательных бактерий. Так, совместная обработка бактериальных клеток белком L-KPP10 и ЭДТА в концентрации 0,5 мМ, повышающей проницаемость мембран, приводит к появлению литического эффекта в концентрациях уже от 3 мкг/мл (рис. 2Б).

Наличие положительно заряженного пептида в составе артилизина существенно изменяло наблюдаемую картину. Так, противомикробная активность артилизина AL-KPP10 проявлялась не только на штамме РА103, но и на четырех из шести клинических изолятов Pseudomonas aeruginosa (таблица 1 и рис. 3). Инкубация артилизина с клетками бактерий в количестве 106 в течение 30 мин приводила к снижению числа колониеобразующих единиц Pseudomonas aeruginosa на 105 кл. в концентрациях 25 и 50 мкг/мл (рис. 3А).

Для визуализации процесса лизиса клетки использовали электронную микроскопию. Для этого восприимчивый к действию артилизина клинический изолят Pseudomonas aeruginosa Ts 43–16 обрабатывали AL-KPP10. Для обработок использовали концентрацию 50 мкг/мл. Инкубировали при комнатной температуре в течение 10, 20 и 30 мин. Визуализировали процесс лизиса под электронным микроскопом после окраски уранилацетатом (рис. 3Б). Как видно из рисунка, клетки Pseudomonas aeruginosa под действием белка теряют клеточную стенку, которую можно наблюдать в виде электронноплотной окрашенной массы, похожей на стружки.

Инкубация AL-KPP10 с чувствительными штаммами Pseudomonas aeruginosa значительно снижает количество бактерий, выросших на чашках Петри, что показано на примере клинического изолята Ts 49–16 (рис. 3В).

ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящее время идет активный поиск различных фаголизинов для борьбы как с грамположительными, так и с грамотрицательными бактериями. Однако использование фаголизинов против грамотрицательных возбудителей затруднено из-за наличия наружной мембраны, препятствующей действию фермента на пептидогликан, поэтому необходимы вещества, увеличивающие проницаемость наружной мембраны. В качестве таковых могут использоваться полимиксины и их производные, аминогликозиды, ЭДТА, лимонная кислота и т. д. [11]. Например, были опубликованы результаты по эндолизину KZ144, полученному из антисинегнойного бактериофага phiKZ. Эндолизин KZ144 проявлял свои антимикробные свойства в присутствии пермеабилизаторов [12]. Еще одним примером служит запатентованный эндолизин OBPgpLYS. Данный белок обладает широким спектром действия на грамотрицательные бактерии и способен снижать количество бактерий на один порядок. При этом было показано, что добавление ЭДТА в небольших концентрациях увеличивает антимикробный эффект против Pseudomonas aeruginosa с множественной лекарственной устойчивостью на 102–103 [13].

Для того чтобы не задействовать дополнительные реагенты, увеличивающие проницаемость наружных мембран, был создан новый класс фаголизинов — артилизины [14, 15, 16]. Эти соединения представляют собой слитые в одной рамке трансляции эндолизин и положительно заряженный пептид, который позволяет перенести молекулу через наружную мембрану грамотрицательных бактерий. Один из перспективных пептидов для этих целей — миелоидный антимикробный пептид овцы SMAP-29. Эта амфифильная молекула связывается с отрицательно заряженными фосфолипидами мембраны и образует в ней поры за счет встраивания своей гидрофобной части [17]. Примером артилизина, в состав которого входит молекула SMAP-29, служит артилизин Art-175 — модифицированный эндолизин бактериофага KZ144. В отличие от KZ144 артилизин Art-175 может проходить через наружную мембрану Pseudomonas aeruginosa и уничтожать бактерии, в том числе с множественной резистентностью, уменьшая их количество более чем на 104 [16]. При этом было выявлено, что активность фаголизинов может быть шире, чем внутривидовая [18]. Так, для Art-175 была показана эффективность артилизина против бактерий Acinetobacter baumannii, в том числе штаммов, обладающих лекарственной устойчивостью, а также персистирующих форм [19].

Однако SMAP-29 в неизменном виде проявляет цитотоксичность по отношению к эритроцитам человека. В одном из исследований выявляли зависимость антибактериальной и гемолитической активности от длины пептида SMAP-29 и его первичной последовательности. После удаления и замены нескольких аминокислот была выявлена структура [K2,7,13]-SMAP-29(1–17), обладающая оптимальной активностью и не проявляющая нежелательной цитотоксичности [20, 21].

В ходе настоящей работы было получено два рекомбинантных фаголизина — эндолизин L-KPP10 и его модифицированная форма — артилизин AL-KPP10. Изучение физико-химических свойств эндолизина и артилизина показало наличие у них третичной структуры, которая восстанавливается в процессе ренатурации, что позволяет предположить наличие у них ферментативной активности. Оба белка имеют профиль, позволяющий поддерживать высокую стабильность в растворе. Важно отметить, что присутствие положительно заряженного пептида SMAP- 29(1–17) в составе фаголизина KPP10 не меняет структуры и свойств белка (см. рис. 1). Данные результаты позволили перейти к проверке противомикробной активности полученных рекомбинантных молекул.

В ходе работы по проверке бактериолитической активности было показано, что эндолизин L-KPP10 в исследованных концентрациях проявляет активность только в присутствии ЭДТА. ЭДТА как пермеабилизирующий агент способствовал проникновению эндолизина через наружную мембрану к клеточной стенке. Между тем, артилизин AL-KPP10 благодаря наличию в его структуре фрагмента антимикробного миелоидного пептида SMAP-29 ([K2,7,13]- SMAP-29(1–17)) не требует дополнительной пермеабилизации с помощью ЭДТА и оказывает бактерицидный эффект на широкий спектр штаммов Pseudomonas aeruginosa. Так, пять из семи исследованных клинических изолятов Pseudomonas aeruginosa оказались восприимчивыми, а наибольшая активность проявлялась при концентрации белка 25 и 50 мкг/мл. Артилизин в данных концентрациях снижал количество бактерий на 105 в течение 30 мин.

Наиболее близким функциональным аналогом описанного в данной статье артилизина AL-KPP10 является артилизин Art-175, представляющий собой эндолизин KZ144, связанный с пептидом SMAP-29 в неизмененном виде. Как и в случае с AL-KPP10, артилизин Art-175 может проходить через наружную мембрану Pseudomonas aeruginosa и лизировать бактерии. Отличие AL-KPP10 от артилизина Art-175 заключается не только в использовании оригинальной последовательности лизина KPP10, но и наличие модификации укороченного пептида SMAP-29, несущего три аминокислотные замены [позиции K2,7,13], что приводит к снижению цитотоксической активности [20, 21]. Также можно рассчитывать, что активность артилизина AL-KPP10 выше, чем у Art-175, так как, согласно приведенным в настоящей статье данным, AL-KPP10 проявляет активность на порядок выше чем Art-175 [16].

ВЫВОДЫ

Представленные в настоящей статье данные подтверждают работоспособность схемы, при которой возможно достижение литических свойств фаголизинов, действующих на грамотрицательные бактерии не только изнутри клетки, но и снаружи с применением пермеабилизирующих агентов или положительно заряженных пептидов. Это согласуется с ранее опубликованными результатам по эндолизину KZ144 полученному из антисинегнойного бактериофага phiKZ, а также по эндолизину OBPgpLYS, которые проявляли свои антимикробные свойства в присутствии пермеабилизаторов. Таким образом, в будущем можно рассчитывать на получение положительных результатов разработки на основе рекомбинантных фаголизинов препаратов, которые станут реальной альтернативой антибиотикам.