CRISPR-CAS СИСТЕМЫ У БАКТЕРИЙ: СТРОЕНИЕ И КЛАССИФИКАЦИЯ

В настоящее время системы CRISPR-Cas идентифицированы в геномах примерно 40% бактерий и большинства архей (90%) [1, 2]. Эти системы состоят из двух обязательных компонентов: CRISPR¹ -кассет и Cas² -белков. Повторяющиеся последовательности равной длины, перемежающиеся уникальными участками (спейсерами), были описаны еще в 1987 г. в геноме E. coli [3], но об их роли тогда ничего не было известно. В 2000-х годах было описано участие CRISPR-Cas систем в реализации бактериального иммунитета [4, 5], а на настоящий момент уже показано их участие в целом ряде различных клеточных процессов, в том числе в процессах репарации ДНК, в регуляции экспрессии генов, в процессах вирулентности и т. д. [6]. Стоит отметить, что в геноме М. tuberculosis прямые повторы (direct repeats, DR) были обнаружены ещё в 1990-х годах, их полиморфизм подробно изучен, и еще до описания иммунной функции CRISPR-Cas систем DR применялись и применяются в настоящее время при генотипировании (сполиготипировании) микобактерий [7, 8].

CRISPR-Cas системы очень разнообразны, при этом каждая функциональная кассета обязательно содержит три следующих элемента: повторы, спейсеры и лидерную последовательность. Рядом с кассетой располагается локус из cas-генов, кодирующих белки с различными функциональными доменами, взаимодействующими с нуклеиновыми кислотами [9]. Разные наборы cas-генов определяют особенности молекулярного механизма CRISPR-Сas систем, но все же в них можно выделить общие черты. Так, два белка, Cas1 и Cas2, обнаружены в большинстве известных на сегодняшний день активных CRISPR-Cas системах. Эти белки образуют комплекс, который участвует в процессе интеграции новых спейсеров в кассету. Новые спейсеры встраиваются в кассету рядом с лидерной последовательностью. В течение жизни кассеты часть спейсеров может быть утеряна в результате рекомбинации между повторами кассеты [10]. Часть кассеты или даже вся кассета целиком может быть перемещена посредством горизонтального переноса генов (ГПГ) [11].

CRISPR-Cas системы классифицируются по составу cas-локусов; так, согласно современной классификации, они делятся на 2 больших класса, 5 типов и множество подтипов [12]. К 1 классу (типы I, III и IV) относят системы CRISPR-Сas, обладающие мультисубъединичными эффекторными комплексами, в то время как в системах класса 2 (типы II и V) все функции эффекторного комплекса выполняются одним белком, таким как Cas9 [12]. Учитывая исключительную важность CRISPR-Cas систем типа II в биотехнологии, в том числе для геномного редактирования, стоит отметить, что они довольно редко встречаются и были обнаружены исключительно в геномах бактерий [12]. Большинство CRISPR-Сas систем можно однозначно отнести к одному из пяти основных типов. Тем не менее, существует ряд организмов, cas-локусы которых не вписываются в текущую классификацию.

Описывая CRISPR-Cas системы, стоит сделать акцент на генах cas1 и cas2, задействованных в процессе интеграции новых спейсеров. Несмотря на различные доказательства участия обоих генов в процессе интеграции, все ферментативные активности, необходимые для вставки нового спейсера, присущи Cas1, тогда как каталитическая активность Cas2 не требуется ни для образования комплекса Cas1–Cas2, ни для вставки нового спейсера. На сегодняшний день известно, что белок Cas2 представляет собой интерферазу мРНК, которая специфически расщепляет связанные с рибосомой мРНК — такая активность кажется, на первый взгляд, неуместной при интеграции новых спейсеров. Однако в ряде работ упоминается о возможном происхождении Cas2 от древних мобильных элементов, в частности от систем токсин–антитоксин (ТА) [13, 14]. В связи с этим, можно предположить, что Cas2 сохраняет предковую токсиноподобную функцию эндо- РНКазы в системах CRISPR-Cas, но такая ее активность обратимо контролируется посредством ингибирования при взаимодействии с Cas1 и образовании комплекса Cas1– Cas2. Согласно этой гипотезе, когда системы CRISPR-Cas не могут сдержать рост вируса, может активироваться Cas2 (возможно, путем деградации Cas1) и останавливать трансляцию, что, вероятно, приводит клетку к самоубийству либо переводит в состояние покоя. Участие же в интеграции спейсеров для Cas2 может быть связано с регулированием или стабилизацией Cas1 посредством образования комплекса Cas1–Cas2, что одновременно обратимо инактивирует Cas2 [15]. Потенциальное участие Cas2 в процессах перевода бактериальной клетки в персистирующее состояние представляет собой перспективное направление исследований для различных патогенов, в том числе для M.tuberculosis.

ФУНКЦИИ СИСТЕМ CRISPR-CAS У БАКТЕРИЙ

Учитывая широкую распространенность и разнообразие систем CRISPR-Cas, нетрудно понять, почему с каждым днем публикуется все больше доказательств участия этих систем в различных клеточных процессах [6]. Помимо участия CRISPR-Сas систем в адаптивном иммунитете, наиболее известной и описанной функцией данных систем является регуляция экспрессии генов. Так, у присутствующей в почве бактерии Myxococcus xanthus жизненный цикл включает в себя стадии формирования плодового тела и споруляции. Процессы формирования плодового тела и последующая дифференциация его клеток в микроспоры жестко регулируются различными межклеточными сигналами и внутриклеточными сигнальными каскадами, в которых CRISPR-Cas системы типа I-C M. xanthus входят в состав петли положительной обратной связи и принимают участие в споруляции бактерии [16].

На сегодняшний день существуют также доказательства того, что системы CRISPR-Cas могут принимать участие в процессах репарации ДНК. Обнаружено, что очищенный белок Cas1 (YgbT) из Escherichia coli способен физически и генетически взаимодействовать с ключевыми компонентами систем репарации ДНК, включая такие гены, как recB, recC и ruvB [17]. Авторы статьи показали, что штамм, у которого произошла делеция ygbT, демонстрирует повышенную чувствительность к повреждению ДНК. Аналогичные фенотипы авторы наблюдали и у штаммов с удаленным CRISPR-кластером; это свидетельствует по меньшей мере о том, что некоторые компоненты CRISPR-Cas систем вовлечены в процессы репарации ДНК.

Была описана еще одна альтернативная функция систем CRISPR-Cas — участие в формировании биопленок [18]. Авторы исследовали CRISPR-Cas систему 1-F оппортунистического патогена Pseudomonas aeruginosa и показали, что данная система ингибирует образование биопленки. Описанная авторами CRISPR-зависимая способность образования биопленки зависела от взаимодействия конкретного спейсера с его прототипом — протоспейсером, расположенным в геноме бактериофага. Результат данного взаимодействия в итоге приводил к индукции генов, связанных с фагом, индуцирующих в свою очередь гибель поверхностных клеток. Эти данные свидетельствуют о наличие еще одного механизма, присущего системам CRISPR-Cas и не связанного с адаптивным иммунитетом.

У бактерий контроль экспрессии генов обычно происходит на посттранскрипционном уровне различными малыми некодирующими РНК. И хотя описываемые РНК контролируют многие физиологические процессы в клетках, мало кто из них участвует в распознавании интрузивных нуклеиновых кислот — такую роль берут на себя системы CRISPR-Cas. В отличие от различных систем эукариот, бактериальные системы CRISPR-Cas расщепляют ДНК, а это означает, что если они будут участвовать в регуляции эндогенных генов, то неизбежно разрушат бактериальную хромосому. Однако в 2013 г. в Nature была опубликована статья, в которой авторы сообщили о механизме посттранскрипционного контроля у Francisella novicida, при котором ген вирулентности регулируется белком Cas (а именно Cas9) и CRISPR- ассоциированными малыми РНК [19]. Предполагается, что в этом случае Cas9 действует на эндогенную мРНК, а не на ДНК. В настоящий момент взаимосвязь между CRISPR-Cas системами и способностью бактериальных штаммов проявлять повышенную вирулентность или даже резистентность к лекарственным средствам представлена в ряде исследований [20].

Говоря о «новых» функциях CRISPR-Cas систем, некоторые авторы считают, что такие функции, как формирование биопленок у Pseudomonas aeruginosa, являются «побочными продуктами» классической иммунной функции CRISPR-Cas, тогда как другие, например вирулентность у Francisella novicida и регуляция развития у Myxococcus xanthus, являются отдельными, самостоятельными функциями [6]. История последовательного открытия различных функций, присущих системам CRISPR-Cas, начиная с иммунной, очень сходна с историей исследования РНК-интерференции эукариот, для которой тоже первоначально было описано участие в иммунитете, и только потом обнаружено, что РНК-интерференция влияет на многие клеточные процессы, в том числе на регуляцию генов и образование гетерохроматина [21]. Ряд авторов проводят параллель между CRISPR-Cas системами и РНК-интерференцией [22, 23].

CRISPR-CAS СИСТЕМЫ У МИКОБАКТЕРИЙ: ОБЩИЙ ПЛАН СТРОЕНИЯ И ОСОБЕННОСТИ CAS-ОПЕРОНА НА ПРИМЕРЕ М. TUBERCULOSIS H37RV

Род Mycobacterium представлен широким спектром микроорганизмов, включая патогенные для человека, из которых наиболее значимы микобактерии туберкулезного комплекса (МТК). Среди прочих этот комплекс включает в себя Mycobacterium tuberculosis — основного возбудителя туберкулеза. М. tuberculosis генетически гетерогенен и делится на несколько групп, так называемых линий, для каждой из которых характерен определенный набор мутаций, постепенно накапливавшихся в ходе эволюции [24–26]. Изоляты из разных линий различаются фенотипически, в том числе по тенденции к развитию лекарственной устойчивости (ЛУ), уровню вирулентности и патогенности, что влияет на тяжесть течения заболевания [27, 28]. К числу наиболее распространенных и клинически значимых в мире линий М. tuberculosis принадлежат Beijing, Haarlem, LAM, S. Линия Beijing (в особенности недавно сформировавшаяся в ее составе сублиния B0/ W-148) является наиболее эпидемиологически значимой в связи с широким распространением и склонностью к формированию ЛУ-форм [29, 30]. Для линии Haarlem также характерен повышенный уровень вирулентности [28]. Помимо этого, определенный интерес вызывают представители линий EAI и Ural, обладающие, наоборот, сниженной вирулентностью, и в связи с этим менее распространенные [28]. EAI — это древняя линия, имеющая ограниченное распространение на сегодняшний день (преимущественно Юго-Восточная Азия) [31]. Линия Ural, родственная Haarlem, как и EAI не особенно широко распространена и, по-видимому, обладает сниженной трансмиссивностью [32] (рис. 1).

Если учитывать потенциальную роль CRISPR-Cas в вирулентности [19, 20], представляется интересным изучение этой системы у различных линий М. tuberculosis.

На сегодняшний день системы CRISPR-Cas обнаружены у 14 видов микобактерий [34]. Все обнаруженные системы CRISPR-Cas располагаются на хромосоме. CRISPR- кассеты с числом повторов более 5 идентифицированы только у трех микобактериальных видов: M. tuberculosis и M. bovis, относящихся к МТК, и у патогена M. avium. При этом у M. avium рядом с CRISPR-кассетой отсутствуют cas-гены; а структуры CRISPR-локусов M. tuberculosis и M. bovis очень похожи — это отражает тесную эволюционную взаимосвязь между ними и согласуется с их филогенией [34, 35]. Для систем CRISPR-Cas M. tuberculosis характерно строение, типичное для систем типа III-A [34].

Были проанализированы CRISPR-Cas системы из 41 полногеномной последовательности штаммов из различных линий M. tuberculosis, доступных в базе данных RefSeq NCBI: 13 геномов линии Beijing; 3 генома линии B0/W-148; 2 генома линии EAI; 10 геномов линии Haarlem; 1 геном линии Ural; 2 генома линии S; 10 геномов линии LAM. Дополнительно были проанализированы 7 геномов сублинии B0/W-148, 4 генома линии URAL, 3 генома линии EAI и 3 генома линии S в статусе «draft», что было связано с недостаточным количеством «complete»-геномов для данных линий. Генотипирование осуществляли по маркерным полиморфизмам [36–38]. Для ряда геномов генотип изолята был заранее известен из литературных источников. Поиск и анализ CRISPR-Cas систем проводили с помощью двух алгоритмов: CRISPRFinder и CRISPR Recognition Tool [39, 40]. На рис. 2 представлено типичное строение системы CRISPR-Cas у M. tuberculosis на примере штамма H37Rv, являющегося общепринятым референсным геномом.

Большинство проанализированных штаммов M. tuberculosis содержат две длинные CRISPR-кассеты (см. рис. 2) [8]. Исключением является штамм M. tuberculosis 7199–99, относящийся к линии Haarlem, у которого произошла редукция кассеты CRISPR2 с 12-го спейсера и разделяющего кассеты участка, что привело к формированию единой кассеты, содержащей 33 спейсера. Максимальное количество спейсеров в одном геноме — 57 [8], наименьшее количество — 10 (часть штаммов сублинии B0/W-148). Рядом с кассетой CRISPR1 расположено 9 cas-генов: cas2, cas1, csm6, csm5, csm4, csm3, csm2, cas10 (csm1) и cas6 (см. рис. 2). Отличительной особенностью cas-генов у M. tuberculosis является их высокая консервативность. Среди проанализированных геномов не были обнаружены мутации в генах cas1, cas2, csm4, csm2 и cas6. Мутации в других генах единичны и носили случайный характер (табл. 1). Кассета CRISPR2 отделена от первой касссеты участком длиной около ~ 1300 п.н. (см. рис. 2). В данном промежутке аннотированы две транспозазы принадлежащие к семейству IS6110 [34]. Стоит также отметить, что для систем CRISPR-Cas M. tuberculosis характерна короткая лидерная последовательность из 48 п.н. [34].

ОСОБЕННОСТИ CRISPR-CAS СИСТЕМ У РАЗЛИЧНЫХ ЛИНИЙ В СОСТАВЕ M. TUBERCULOSIS

Линия Beijing

Для изолятов линии Beijing характерна делеция региона, содержащего гены cas1, cas2, csm5, csm6 (см. табл. 1) и кассету CRISPR1 [8, 34]. Оставшаяся кассета CRISPR2 содержит не 18, а 14 спейсеров, 10 из которых (Sp1- Sp10) являются общими для всех линий M. tuberculosis, а 4 спейсера (SpB11-SpB14, где B обозначает Beijing) специфичны для рассматриваемой линии (рис. 3). Эти спейсеры не встречаются у представителей других линий M. tuberculosis.

Следует отметить, что в промежутке между геном csm4 и кассетой CRISPR2 у большинства штаммов аннотировано две транспозазы. А сам ген csm4 заметно короче своего ортолога из других линий — длина кодируемого им белка составляет либо 76 а. о., либо 116–118 а. о., тогда как в штаммах из других линий M. tuberculosis — 302 а. о. При длине около 100 а. о. в данном белке не сохраняются консервативные домены, необходимые для его взаимодействия с геном csm3 (внутри комплекса csm1– csm4–csm3) [41]. В связи с этим в линии Beijing, возможно, нарушена стадия интерференции.

Линия Beijing начала формироваться в Северном Китае, Корее и Японии около 7000 лет назад [37] (рис. 4). По всей вероятности, после отделения данной линии формирование кассеты CRISPR2 продолжалось с участием специфичных для неё спейсеров (SpB11-SpB14), что могло быть вызвано отличиями в факторах окружающей среды, с которыми встречался патоген. Далее в линии Beijing произошла потеря нескольких cas-генов, в том числе cas1 и cas2, участвующих в интеграции новых спейсеров, и формирование кассеты прекратилось. Таким образом, для всей линии характерно наличие единственной кассеты CRISPR2, включающей в себя 14 спейсеров. Однако у ряда изолятов в составе молодой в эволюционном отношении сублинии B0/W-148, входящей в состав линии Beijing, обнаружена утрата нескольких спейсеров. У одной части этих изолятов отсутствуют спейсеры SpB13 и SpB14, а у другой части нет всех 4 спейсеров (SpB11- SpB14), специфичных для линии Beijing. Стоить отметить, что спейсеры SpB11-SpB14 были также обнаружены нами в составе кассеты у некоторых штаммов M. bovis.

Высокая частота возникновения мутаций и снижение репарации ДНК, описанные в литературе у линии Beijing [42], возможно связанные с редукцией CRISPR-Cas системы, потенциально могут служить причиной изменчивости линии и приводить к возникновению ЛУ. Предположение, что редуцированные или отсутствующие CRISPR-Cas системы связаны с ЛУ, соответствует результатам, полученным в недавно проведенном исследовании патогенной бактерии Campylobacter jejuni, в котором штаммы, вызывающие наиболее тяжелые гастроэнтериты и постинфекционные осложнения, также имели укороченные CRISPR-кассеты или полностью были лишены CRISPR-Cas систем [20, 43].

Линии Ural и Haarlem

Для линий Ural и Haarlem характерны инсерции спейсеров. Они происходят в кассете CRISPR1 после Sp3. Наличие вставки характерно только для части проанализированных изолятов Haarlem и всех изолятов линии Ural. Стоит отметить, что данные спейсеры встречаются среди некоторых изолятов M. bovis, а также у двух изолятов линии EAI, в связи с чем нельзя исключать наличие событий рекомбинации и горизонтального переноса генов (ГПГ).

Нами были также зафиксированы единичные случаи потери и приобретения спейсеров в кассете CRISPR2 у линий Ural и Haarlem. Так, у 3 изолятов линии Ural наблюдается потеря спейсеров Sp4-Sp6 в кассете CRISPR2, а у 2 изолятов линии Нaarlem — потеря спейсера Sp6 из второй кассеты.

Линия EAI

Для линии EAI характерны наиболее протяженные CRISPR- кассеты среди всех линий M. tuberculosis. Возможно, это отчасти связано с тем, что линия EAI одна из наиболее древних. В ряде случаев длина кассеты CRISPR2 превышает 24 спейсера, а длина кассеты CRISPR1 — 30. Наибольшее количество спейсеров нами было обнаружено у изолята HN-024: 25 спейсеров для кассеты CRISPR1 и 34 спейсера для кассеты CRISPR2, среди которых присутствует ряд уникальных для этой линии спейсеров.

Линии S и LAM

Для линий S и LAM в общем характерно каноническое для M. tuberculosis строение CRISPR-Cas системы (см. рис. 2). В этих линиях может наблюдаться некоторый полиморфизм, например, у двух изолятов линии LAM в одном случае встречается потеря спейсеров Sp4-Sp6 кассеты CRISPR1, а в другом случае — потеря спейсера Sp20 из этой же кассеты.

В общем, описывая особенности кассет систем CRISPRCas M. tuberculosis, можно сказать, что кассета CRISPR1 отличается значительной вариабельностью, что и позволяет использовать ее для генотипирования [8]. Несмотря на то, что делеция спейсеров довольно распространена, среди десяти дистальных спейсеров Sp1-Sp10 кассеты CRISPR2 (по отношению к лидерной последовательности), являющихся предковыми и отличающихся высокой консервативностью, она практически не наблюдается, так же, как и мутации. Протоспейсеры для них до сих пор не установлены. Кроме того, хотя древние спейсеры и оцениваются часто как малозначимые по причине высокой изменчивости и быстрой эволюции профагов, защиту от которых они обеспечивали, они сохраняются неизменными у всех рассмотренных нами линий M. tuberculosis, не подвергаясь делеции. Поэтому возможно и другое объяснение: данные спейсеры могут иметь большое значение для жизнедеятельности бактерии, и их роль еще только предстоит узнать.

ПОИСК ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ПАРТНЕРОВ И КОМПЕНСАТОРНЫХ МЕХАНИЗМОВ ПРИ РЕДУКЦИИ ЧАСТИ СИСТЕМЫ CRISPR-CAS У ЛИНИИ BEIJING

Поиск возможных функциональных партнеров и механизмов компенсации функций генов сas1, сas2, сsm5, сsm6 у представителей линии Beijing осуществляли с помощью метода филогенетического профайлинга генов в последовательностях геномов штаммов различных линий M. tuberculosis (анализировали 130 полногеномных последовательностей, доступных в NCBI). Филогенетический профиль (ФП) представляет собой бинарный вектор, определяющий наличие кодирующей последовательности изучаемого белка в геномах группы организмов [44]. Предполагается, что эволюция генов, принадлежащих к одному функциональному пути, происходит совместно, поэтому гены, характеризующиеся сходными или инвертированными ФП, могут выступать в качестве кандидатов на роль функциональных партнеров или компенсаторных механизмов соответственно.

Филогенетический профайлинг включал в себя определение групп ортологов в геномах штаммов различных линий M. tuberculosis, построение бинарных векторов, построение матрицы попарных расстояний между векторами и кластеризацию ФП. Построение и визуализацию ФП генов проводили с использованием программ OrthoFinder v.2.0.0 [45] и Count [46]. Матрицу попарных расстояний между ФП получали с использованием значений взаимной информации (MI): DMI=1–MI. Кластерный анализ проводили с помощью метода невзвешенного попарного среднего (UPGMA) [47].

Оценка результатов кластерного анализа ФП позволила установить гены, характеризующиеся сходным характером эволюционных событий по отношению к анализируемым генам сas1, сas2, сsm5, сsm6 (рис. 5, А). Потеря части системы CRISPR-Cas у ряда изолятов M. tuberculosis (принадлежащих линии Beijing) сопровождалась, по- видимому, по крайней мере двумя эволюционными событиями потери и событием приобретения участков генома (в разных участках хромосомы) (рис. 5, Б, В).

В первом случае, в результате анализа ФП в геномах линии Beijing M. tuberculosis были обнаружены специфичные для линии протяженные делеции. В результате данных событий ортологи генов Rv0071, Rv0072, Rv0073 и Rv1761c, Rv1760, Rv1758 (идентификаторы соответствуют генам в геноме M. tuberculosis H37Rv) (табл. 2) приобрели схожие ФП (профили партнеров, см. рис. 5, Б). Стоит отметить, что хромосомный регион, содержащий гены Rv1761c, Rv1760 и Rv1758, фланкирован инвертированными повторами IS-элементов IS6110, относящихся к семейству IS3. Во втором случае, в результате анализа ФП в геномах линии Beijing M. tuberculosis была обнаружена специфичная для линии протяженная инсерция, и в результате этих событий ортологи генов CFBS_RS10335, CFBS_RS10345, CFBS_RS10350, CFBS_RS10355, CFBS_RS10360, CFBS_ RS10365, CFBS_RS21395 (идентификаторы соответствуют генам в геноме M. tuberculosis CCDC5079) (см. табл. 2) приобрели близкие к инвертированным ФП (профили компенсаторов, см. рис. 5, B).

Таким образом, в ходе анализа ФП были обнаружены гены со сходным характером эволюционных событий: было установлено, что потеря генов cas1, cas2, csm5, csm6 у представителей линии Beijing M. tuberculosis сопровождалась событиями потери и приобретения ряда других генов (см. табл. 2). Данные гены-кандидаты потенциально способны участвовать в механизмах компенсации функций cas-генов или являться функциональными партнерами cas-генов у M. tuberculosis, что служит предметом дальнейших экспериментальных исследований.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

У M. tuberculosis наблюдается значительная вариативность систем CRISPR-Сas, от протяженных кассет, характерных для линии EAI, до частично редуцированных систем CRISPR-Сas у линии Beijing. Таким образом, наличие активной системы CRISPR-Cas типа III-A не является обязательным условием для эволюционного успеха (в отношении патогенности, вирулентности, трансмиссивности и адаптируемости) линии.

Утрата части кассеты и ряда cas-генов представителями линии Beijing M. tuberculosis привела, по-видимому, к полной или частичной потере способности их систем CRISPR-Cas разрушать чужеродную ДНК. Нарушение функционирования системы CRISPR-Cas у одной из наиболее успешных линий M. tuberculosis могло сопровождаться механизмами компенсации утерянных генов (например, в результате проведенного анализа была обнаружена специфичная для линии Beijing протяженная инсерция); а также утратой функциональных партнеров cas-генов, так как в общем случае предполагается, что ген, утративший своего функционального партнера, не будет сохраняться в геноме в результате отбора и подлежит элиминации, как подтверждение этому — обнаруженные специфичные для линии Beijing протяженные делеции. Следует отметить, что обнаруженные в ходе анализа закономерности в характере эволюционных событий потери и приобретения генов могут носить случайный характер и подлежат экспериментальной верификации. Филогенетический профайлинг позволяет выдвинуть гипотезы и предоставляет необходимый для дальнейшего изучения материал.

Несмотря на то, что система CRISPR-Cas у представителей линии Beijing M. tuberculosis может быть неактивна, предполагается, что в случае линий, у которых присутствуют полный набор cas-генов и повторы, система сохраняет активность и способна участвовать в защите от чужеродной ДНК [34]. Учитывая короткую лидерную последовательность, характерную для всех систем CRISPR-Cas M. tuberculosis, возможно, при изучении этих систем у данного организма стоит отдать предпочтение исследованию их альтернативных функций, таких как регуляция экспрессии генов, репарация ДНК, формирование вирулентности и других.

Строение CRISPR-Cas системы M. tuberculosis изучено и описано достаточно подробно [8], а роль этих систем остается неизвестной. Для большинства микобактериальных спейсеров до настоящего времени не удалось найти протоспейсеры среди известных микобактериофагов. Это может быть связано с тем, что большая часть бактериофагов M. tuberculosis была выделена с использованием в качестве хозяина M. smegmatis с последующей проверкой способности поражать М. tuberculosis [34]. Разница в наборе спейсеров, наблюдаемая у различных линий, может привести к потенциальному различию в реализации бактериального иммунитета и, как следствие, к различной устойчивости к фагам, а также разнице в регуляции экспрессии. Помимо спейсеров интерес вызывает изучение роли белка Cas2 вне комплекса Cas1-Cas2, в связи с выдвинутой ранее гипотезой [15], что при «самостоятельной» активации данный белок способен прекращать трансляцию, и, вероятно, тем самым переводить клетку в состояние покоя, либо провоцировать апоптоз. Также представляет интерес поиск ингибиторов для Cas2. Особое внимание стоит обратить на возможную функциональную связь между системами CRISPR-Cas, в частности cas-генами, и TA-системами [38]. Возможное участие систем CRISPRCas в вирулентности и устойчивости к лекарственным препаратам позволит разработать новые подходы в борьбе с лекарственно-устойчивыми штаммами M. tuberculosis.

¹ От англ. clustered regularly interspaced short palindromic repeats —короткие полиндромные повторы, регулярно расположенные группами.

² От англ. CRISPR-associated proteins.