Грамотрицательная гамма-протеобактерия Escherichia coli (E. coli) была впервые обнаружена в 1885 г. Теодором Эшерихом в стуле здоровых пациентов [1]. В природе E. coli распространена в нижнем отделе кишечника теплокровных организмов и служит важным объектом научных исследований. В настоящее время четыре штамма E. coli (K-12, B, W и С) используют в качестве модельных организмов. Штамм K-12 был получен в 1922 г. сотрудниками Стэнфордского университета [2]. Штамм В описан в 1918 г. Д`Эрелем в Институте Пастера в Париже [3]. О двух других, менее распространенных штаммах, сообщили в 1951 г. Маргарет Лейб (штамм С) [4, 5] и в 1943 г. Селман Ваксман (штамм W) [6]. Наиболее распространенные и известные штаммы принадлежат к группе K-12 и В. Лабораторные штаммы в ходе своей «эволюции» в условиях научных лабораторий оказались лишены ряда свойств, например, образования биопленок на абиотических поверхностях, что сделало их удобным объектом для исследований, в том числе поиска антибиотиков [7]. Под действием комбинации естественного и искусственного отбора в лабораторных условиях были получены множественные производные штаммов K-12 и В, которые хорошо известны и используются исследователями повсеместно (табл. 1). Примерами производных штамма В могут служить известные штаммы BL21 и BL21(DE3), а штамма K-12 — DH5α, JM109, W3110, XL-1 Blue, MG1655.

В настоящее время перед учеными стоит сложная задача поиска либо новых антибиотиков, либо эффективной их замены. Одно из наиболее перспективных направлений — выявление ингибиторов помп множественной лекарственной устойчивости (МЛУ), отвечающих за активное удаление антибиотиков из бактериальной клетки. Данные, полученные на делеционных (нокаутных) мутантах, свидетельствуют: удаление генов, кодирующих помпы МЛУ может приводить к многократному снижению минимально действующей концентрации антибиотика [8], что имеет положительные аспекты в результате уменьшения как финансовых затрат на лечение пациента, так и токсичного действия антибиотикотерапии на организм. Хотя в настоящее время существует довольно много работ, посвященных исследованию влияния помп МЛУ на действие различных антибактериальных агентов, есть большой перечень объективных причин, которые не позволяют сравнивать данные, полученные в ходе исследований, друг с другом. К таким факторам можно отнести различный генетический фон штаммов, на которых проводилось исследование. Даже в случае близкородственных штаммов W3110 и MG1655 [9] существует более 200 различных модификций генома, что затрудняет сравнение результатов. В силу того, что фактором, влияющим на резистентность, служит наличие или отсутствие определенной помпы, мы предположили, что для всех штаммов E. coli с идентичными последовательностями помпы МЛУ будет иметь место сопоставимая или равная резистентность. Для исследования выбрали помпу МЛУ AcrAB-TolC. Таким образом, целью работы было сравнение последовательностей белков AcrA, AcrB и TolC у разных лабораторных штаммов E. coli и при наличии мутаций в них — изучение взаимосвязи между мутациями и резистентностью.    

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Выбор объектов исследования

В качестве объектов исследования мы выбрали штаммы группы К-12: W3110, MG1655, NEB 5-alpha, MDS42, GM4792, AG100, MC4100, DH10B, ER3413, HMS174, BW2952, BW25113, и штамм группы В — BL21(DE3), чьи белковые последовательности генов acrA, acrB, tolC известны и депонированы (табл. 2). 

Выбор референсной последовательности

При выборе референсной последовательности мы приняли во внимание наличие большого числа делеционных мутантов у штамм E. coli str. K-12 substrain BW25113. Штамм является базовым для коллекции делеционных мутантов Keio, включающей в себя штаммы с делециями 3985 генов из 4288 генов E. coli [10]. В качестве референсной последовательности AcrA выбрали последовательность AIN30961.1, референсной последовательности AcrB выбрали последовательность AIN30960.1 и референсной последовательности TolC — последовательность AIN33386.1.

Выравнивание последовательности

Анализ последовательностей осуществляли с использованием стандартных средств поиска локальных выравниваний NCBI BLASTp с функцией множественного сравнения [11], а также с использованием функции сравнения последовательностей программы STRING [12]. Визуализацию проводили с помощью программы NCBI MSA Viewer [13]. Последовательности каждого белка-компонента выравнивали относительно референсной последовательности.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Известно, что бактериальная резистентность может являться результатом нескольких процессов: 1) накопления генов резистентности на плазмидах; 2) увеличения уровня экспрессии генов, кодирующих помпы МЛУ; 3) дупликации генов; 4) накопления мутаций [14, 15]. Изменение уровня экспрессии и накопление мутаций в генах, кодирующих помпы МЛУ, могут определяться точечными мутациями в аминокислотных последовательностях белков. Таким образом, изменение бактериальной резистентности может быть предсказано на основе анализа последовательностей.

Бактериальные гены подразделяются на гены «домашнего хозяйства» (housekeeping genes), обеспечивающие поддержание важнейших функций клетки и гены «роскоши» (contingency genes), которые играют важную роль в адаптации бактерий к изменяющимся условиям окружающей среды. Гены «домашнего хозяйства» обычно мутируют с низкой частотой, тогда как гены «роскоши» обладают высокой частотой мутации [16]. Считается, что гены помп МЛУ относятся к генам «роскоши», поэтому должны иметь довольно большую вариабельность первичной структуры белков, кодируемых ими. Так как лабораторные штаммы обычно подвержены давлению искусственного отбора, вызванного использованием различных биоцидов и мутагенов, можно предположить, что культивируемые на протяжении почти 100 лет штаммы и их производные, используемые в лабораториях различных стран, будут довольно сильно различаться по аминокислотному полиморфизму. Сравниваемые штаммы происходят из разных стран и континентов (табл. 1), поэтому можно предположить наличие мутаций в каком-либо из генов помпы МЛУ AcrAB-TolC.

Однако проведенный нами анализ выравнивания последовательностей белков AcrA (рис. 1), AcrB (рис. 2) и TolC (рис. 3) субштамма BW25113 и последовательностей штамма К-12 (субштаммы W3110, MG1655, NEB 5-alpha, MDS42, GM4792, AG100, MC4100, DH10B, ER3413, HMS174, BW2952) и штамма В (субштамм BL21(DE3)), показал отсутствие полиморфизмов во всех трех белках помпы МЛУ AcrAB-TolC, независимо от того, принадлежит субштамм к производным штамма К-12 или штамма В.

Принимая во внимание тот факт, что частота мутирования у E. coli составляет ~1×10^-3 на геном за деление [17] а, по другой оценке, даже чуть выше (3–4×10^-3 на геном за деление) [18], можно предположить, что последовательность помпы AcrAB-TolC консервативна. Идентичность последовательностей составила 100% при одинаковой длинне покрытия для каждого из исследуемых белков (397 аминокислотных остатков — для AcrA, 1049 аминокислотных остатков — для AcrB и 493 аминокислотных остатка — для TolC).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Согласно современной классификации, штаммы группы В и К-12 относят к одной филогенетической группе А [19], что могло бы объяснить сходство аминокислотных последовательностей всех трех белков, однако не их идентичность. Из полученных нами результатов можно сделать вывод о наличии консенсусной последовательности очень консервативного ансамбля помпы МЛУ AcrAB- TolC. Таким образом, выбранные нами референсные последовательности белков AcrA (AIN30961.1), AcrB (AIN30960.1), и TolC (AIN33386.1) являются консенсусными для исследуемых штаммов E. coli.

Обнаруженные в работе последовательности будут являться консенсусными для представителей всей филогенетической группы А, а возможно и других филогенетических групп (B1, B2, D, и E), что может быть использовано в дальнейшем для нормирования исследованных последовательностей относительно консенсусной.

Отсутствие точечных мутаций в генах, кодирующих белки-компоненты помпы AcrAB-TolC, для всех исследуемых штаммов свидетельствует о жестком контроле отбора, как и в случае с генами «домашнего хозяйства». Такой контроль особенно важен для основной помпы МЛУ E. coli  AcrAB-TolC, отвечающей за удаление различных веществ, таких как бензалкония хлорид, бромистый этидий, индол, гексан, антибиотики (эритромицин, ципрофлоксацин и т. д.), родамин, берберин, а также трифенилфосфоний и его производные [20– 21].

Необходимо отметить, что было бы неправильно рассматривать гены МЛУ только как гены, отвечающие за резистентность к биоцидам. Было показано их немаловажное значение в колонизации и персистенции бактерий [22], поэтому их роль не ограничена функцией защиты от антибактериальных агентов. По-видимому, продукты генов МЛУ выполняют рутинную работу по защите бактериальной клетки от различных веществ биотического и абиотического происхождения и заслуженно могут быть рассмотрены как своеобразные гены «домашнего хозяйства», занятые перманентной «уборкой», а не как гены «роскоши», включающиеся в работу только в определенный период времени.

ВЫВОДЫ

Полученные данные позволяют говорить об исключительной роли, которую выполняет в клетке E. coli помпа МЛУ AcrAB-TolC, последовательность белков которой оказалась неожиданно сверхконсервативной. Это позволяет рассматривать работу помпы МЛУ AcrAB-TolC под иным углом — как постоянную защиту бактериальной клетки от различных факторов окружающей среды; от работы помпы МЛУ зависит не только резистентность бактерии к антибиотикам и их альтернативам, но и само выживание бактерии.