Мультиформные глиобластомы — наиболее агрессивные опухоли головного мозга, для которых в настоящее время нет эффективной терапии, а средний период выживаемости пациентов после постановки диагноза и проводимого лечения составляет всего 15 месяцев [1, 2]. Трудности терапии глиобластом объясняются слабой проницаемостью через гематоэнцефалический барьер применяемых химиотерапевтических препаратов, а также способностью опухолевых стволовых клеток проникать вглубь здоровой ткани мозга и тем самым избегать хирургического удаления. В последнее время надежды на преодоление тупиковой ситуации с терапией глиобластом связывают с использованием онколитических вирусов. Описаны случаи успешного лечения и длительных многолетних ремиссий при их использовании [3–8]. Более того, установлена возможность уничтожения опухолевых стволовых клеток глиобластом под действием вирусов [9–14]. Однако несмотря на описанные случаи вирусной терапии глиобластом, применение онколитических вирусов оказывается эффективным только для части пациентов. Это связано с различиями молекулярно- генетических повреждений в клетках опухолей пациентов, влияющих на чувствительность к отдельным штаммам вирусов. Поэтому для достижения терапевтического эффекта целесообразно использование панелей онколитических вирусов, обладающих перекрывающимся спектром тропизма в отношении разных индивидуальных опухолевых клеток. Одним из подходов к более эффективному использованию вирусов может быть предварительное испытание индивидуальной чувствительности опухолевых клеток пациента к ряду препаратов онколитических вирусов с целью подбора наиболее эффективных вариантов. Для испытания необходимо получить жизнеспособные клетки из удаленного у пациента фрагмента опухоли и пассировать культуры клеток опухоли с целью установления причин их дифференциальной чувствительности к различным вирусам. Для отработки такого подхода мы провели оптимизацию процедуры получения живых клеток из глиобластом, их хранения в жизнеспособном состоянии в условиях глубокой заморозки, а также последующего пассирования в культуре клеток. Основной целью работы было определение, насколько клетки в культуре при их пассировании способны сохранять исходную чувствительность к испытуемому вирусу. В настоящем исследовании мы получили ряд культур клеток от пациентов и сравнили их ответ на заражение несколькими онколитическими энтеровирусами на различных стадиях, начиная от органной первичной культуры, и вплоть до десяти пассажей в культуре.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Линии клеток мультиформной глиобластомы

Клетки глиобластом U87MG и A172 из Американской коллекции клеточных культур (ATCC) выращивали в среде DMEM (ПанЭко, Москва) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 4 мМ L-глутамина, 100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина в атмосфере 5% СО2 и при температуре 37 °С. Первичные органные культуры глиобластом приготовляли из свежих кусочков удаленных опухолей пациентов.

Получение органных и первичных культур глиобластом

Опухолевый материал получали в НИИ нейрохирургии имени Н. Н. Бурденко, согласно протоколу, утвержденному этическим комитетом организации. Образцы опухолевой ткани забирали в стерильные пробирки, заполненные питательной средой DМЕМ и хранили при +4 °С не более суток. Для получения органных культур кусочки опухоли промывали фосфатно-солевым буфером, помещали на стерильную чашку Петри и с помощью пинцета и скальпеля удаляли участки некроза и кровеносные сосуды. Для получения клеточной суспензии опухоли продавливали через одноразовые стерильные культуральные нейлоновые сетки с размером отверстий 50 микрон, промывали три раза центрифугированием при 800 g 5 мин, суспендировали в ростовой среде, аккуратно пипетировали до получения гомогенной взвеси частиц, содержащих отдельные клетки или их агрегаты. Для консервирования жизнеспособных органных культур при температуре жидкого азота суспензию частиц помещали в среду DMEM, содержащую 50% сыворотки и 7% диметилсульфоксида, разливали по 1 мл в криопробирки. Замораживание проводили в хорошо изолированном контейнере при температуре – 80 °С в течение суток, после чего ампулы переносили в жидкий азот. Для получения первичных культур глиобластом после диспергирования и доведения до плотности 2 × 104 частиц в 1 мл ростовой среды DMEM-F12 (ПанЭко, Москва) с добавлением 10% ЭТС и антибиотиков производили высевание клеток на 6-см культуральные пластиковые чашки Петри и инкубировали в атмосфере 5% СО₂ и температуре 37 °С. Каждые 3 суток проводили замену среды. Рост клеток отмечали два раза в неделю. После образования неплотного монослоя (через 6–15 суток) клетки либо консервировали в жидком азоте, как описано выше, либо пассировали далее. 

Пассирование культур глиобластом

При посеве первичных культур образование устойчивого роста до достижения монослоя наблюдали приблизительно у трети культур. Остальные высеянные клетки прекращали деление, вероятно в связи с отсутствием необходимых условий. Для пассирования выросших культур монослои отмытых клеток обрабатывали раствором трипсина и сажали на новые чашки в соотношении 1:2–1:3. Пассирование продолжали в течение длительного времени, и на каждом пассаже часть клеток подвергали криоконсервированию. 

Штаммы онколитических вирусов

В работе использовали непатогенные штаммы энтеровирусов человека: вакцинный штамм полиовируса 1 типа (Сэбин), вирусы Коксаки А7 (ЖЭВ8), Эховирсу 1 (ЖЭВ4) и Эховирус12 (ЖЭВ7) [4, 15]. Энтеровирусы наращивали в культуре клеток почки африканской зеленой обезьяны Vero путем заражения с множественностью менее 1 БОЕ/кл. и сбора вирусного урожая через 24 ч. Вирусные титры определяли методом конечных разведений на культурах клеток Vero.

Анализ жизнеспособности клеток после инфицирования вирусами

96-луночные планшеты с клетками первичных и перевиваемых линий инфицировали 10-кратными серийными разведениями вирусов в диапазоне множественностей от 10^-5 до 1 БОЕ/клетку, в четырех повторах. Адсорбцию вируса проводили в течение 1 ч, далее удаляли вируссодержащую жидкость, промывали фосфатно-солевым буфером и культивировали в ростовой среде с 2% ЭТС. Через 72 ч определяли жизнеспособность клеток с помощью MTT теста, пользуясь набором реактивов CellTiter 96® Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (Promega, США) в соответствии с инструкцией производителя.

Анализ вирусной репродукции в инфицированных клетках

Через 5 суток после заражения в планшетах выбирали лунки, где при минимальной дозе вируса наблюдался полный лизис клеток. После трех циклов замораживания–размораживания супернатанты осветляли центрифугированием (10 мин, 1000 g) и использовали для определения вирусного титра как описано выше.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Мы измерили чувствительность к нескольким штаммам непатогенных энтеровирусов опухолевых клеток, полученных от трех больных и находящихся на различных уровнях пассирования в культуре. Было проведено сравнение первичных культур глиобластом, а также культур 6 пассажа.  Время пассирования составляло около двух месяцев, за которые клетки в культурах успевали пройти около 700 делений. Для определения минимальной дозы вируса, необходимой для эффективного заражения, культуры глиобластом инкубировали с серийными десятикратными разведениями стандартных вирусных препаратов и через 72 ч измеряли жизнеспособность клеток.
На рис. 1А представлены профили чувствительности к четырем энтеровирусным штаммам первичных культур клеток, приготовленных из опухолей трех пациентов (обозначены как GM-3564-0, GM-3876-0 и GM-3912-0). В качестве контроля испытывали чувствительность к вирусным штаммам стандартной культуры клеток Vero, на которой эти вирусы регулярно пассируются. На рис. 1Б представлены результаты измерения чувствительности к тем же четырем вирусным штаммам культур клеток глиобластом, прошедших по 6 пассирований в культуре клеток (обозначены как GM- 3564-6, GM-3876-6 и GM-3912-6). В качестве контроля также была использована линия Vero, чувствительность которой оценена в повторе (Vero-2).

Видно, что чувствительность к четырем штаммам энтеровирусов у трех первичных культур клеток глиобластом существенно различалась. Культура GM-3564 наиболее чувствительна к вирусу Коксаки А7 (инфицируется 10^-6- кратным разведением вирусного препарата), менее чувствительна к полиовирусу (инфицируется 10^-4-кратным разведением), и очень слабо чувствительна к Эховирусам 1 и 12 (инфицируется 10^-3-кратным разведением). Культура GM-3876 наиболее чувствительна к полиовирусу (инфицируется 10^-6-кратным разведением), далее — к вирусу Коксаки А7 (10^-5-кратное разведение), Эховирусу 12 (четвертое разведение) и Эховирусу 1 (третье разведение).  Культура GM-3912 наиболее чувствительна к вирусу Коксаки А7 (седьмое разведение), далее к полиовирусу (пятое разведение) и Эховирусам 1 и 12 (четвертое разведение).  Испытание вирусных препаратов на культуре Vero указывает на наибольшую активность Эховируса 1 (седьмое разведение), далее — полиовируса и вируса Коксаки А7 (шестое разведение) и Эховируса 12 (пятое разведение). Видно, что в результате пассирования произошли качественные изменения чувствительности клеток глиобластом к отдельным вирусам. В клетках GM-3564 произошло повышение чувствительности к полиовирусу 1 типа, и некоторое снижение чувствительности к вирусу Коксаки А7, в то время как чувствительность к Эховирусам 1 и 12 не менялась. В клетках GM-3876 также наблюдалось повышение чувствительности к полиовирусу и снижение чувствительности к вирусу Коксаки А7, и кроме того некоторое повышение чувствительности к Эховирусу 12, при неизменной низкой чувствительности к Эховирусу 1. В клетках GM-3912 наблюдалось лишь некоторое повышение чувствительности к Эховирусу 12 при неизменной чувствительности к остальным трем вирусам.

Различия в чувствительности клеток глиобластом к отдельным вирусам, а также наблюдаемые изменения при пассировании могли быть связаны с изменениями репродукции вирусов. Для установления количественных параметров репродукции инфекционных вирусов были определены титры инфекционности в супернатантах культур, зараженных предпоследним разведением, вызвавшим цитопатическое действие. Инфекционная доза в предпоследнем разведении составляла около десяти инфекционных единиц на лунку 96-гнездного планшета, что является оптимальной дозой, гарантирующей заражение культуры, и в то же время позволяющей избегать наработку и накопление дефектных интерферирующих частиц. В таблица представлены результаты определения инфекционных титров вирусов в каждой из первичных и пассированных культур клеток глиобластом.  

Результаты определения титров частиц подтверждают предположение о том, что изменения чувствительности к заражению вирусами в процессе пассирования клеток связаны с более или менее эффективной репликацией того или иного вируса. Так, при пассировании культуры GM3564 репродукция полиовируса возросла более чем в 30 раз, при одновременном трехкратном снижении продукции вируса Коксаки А7 и практически неизменном уровне репликации Эховирусов 1 и 12. Разнообразные изменения спектров чувствительности отмечались и в двух других культурах.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Мультиформная глиобластома является крайне агрессивной формой опухолей головного мозга. Геном ее клеток очень нестабилен, в связи с чем популяция клеток опухоли постоянно претерпевает изменения и крайне неоднородна.  Если в условиях организма за счет действия ряда факторов наблюдается определенный баланс клеточного состава внутри опухоли, то при переводе в культуру часть клеток может прекратить деления. Это приводит к перерастанию отдельных более приспособленных к культивированию in vitro типов опухолевых клеток. В связи с этим можно предположить, что отбор определенных типов клеток в популяции может сопровождаться и изменениями в чувствительности к действию онколитических вирусов.

Полученные в ходе исследования результаты указывают на то что в ходе пассирования первичных опухолей происходят определенные изменения, приводящие к возрастанию или уменьшению чувствительности к отдельным вирусам. Это может быть связано с исходной гетерогенностью популяции опухолевых клеток, которые по ряду причин могут различаться по чувствительности к вирусам. В культуре происходит перерастание определенного клеточного компонента, в результате чего меняется и общий уровень чувствительности к вирусам.

ВЫВОДЫ

Проведенное испытание чувствительности к четырем штаммам онколитических энтеровирусов опухолевых клеток от трех больных глиобластомами дает основание сделать вывод, что опухоли исходно обладают индивидуальными спектрами чувствительности к панели вирусов и что при пассировании происходят качественные изменения чувствительности к отдельным вирусным штаммам. Результаты указывают на необходимость проведения тестирований чувствительности к вирусам на самых ранних стадиях перевода клеток в культуру.