Терапия опухолей головного мозга по-прежнему остается проблемной, особенно в случае мультиформной глиобластомы, наиболее злокачественной и практически неизлечимой болезни [1]. Инфильтративный рост и расположение в функционально важных областях мозга делают эти опухоли чрезвычайно сложными для хирургического вмешательства. Из-за опасности возникновения неврологических нарушений хирургическое лечение часто ограничивается лишь частичным удалением опухоли. Однако даже в случаях радикального удаления рецидивы заболевания неизбежны, так как инициирующие опухоль стволовые клетки глиобластомы глубоко мигрируют в здоровые области мозга и не могут быть удалены [2–4]. Химио- и радиотерапия также приводят лишь к краткосрочным ремиссиям, после которых неизбежен вторичный рост [4]. Существующие в настоящее время варианты лечения глиобластом почти исчерпаны, что оправдывает поиск новых альтернативных подходов для избирательного и эффективного уничтожения злокачественных клеток. Значительный прогресс в понимании механизмов злокачественного роста и специфических свойств клеток глиобластомы является хорошей основой для разработки инновационных терапевтических подходов. Среди них особенно многообещающим является использование непатогенных онколитических вирусов, которые специфически распознают и уничтожают клетки глиобластомы [5, 6].

Онколитические вирусы для лечения глиом человека разрабатываются на основе вирусов, принадлежащих ко многим семействам, и включают вирусы герпеса, вирус болезни Ньюкасла [7–11], аденовирусы [12–16], парвовирусы [17–19], реовирусы [20–23], энтеровирусы [24–27] и другие [1]. Многочисленные клинические испытания показали отсутствие токсичности препаратов онколитических вирусов [28–31]. Кроме того, в отличие от химио- и таргетной терапии многие онколитические вирусы способны эффективно убивать инициирующие опухоль стволовые клетки [16, 32–37], что безусловно важно для полного излечения пациентов. В настоящее время уже существует широкий арсенал потенциальных вирусных терапевтических штаммов, которые могут быть использованы для дальнейших клинических испытаний. В настоящее время активно изучаются свойства непатогенных штаммов вирусов Коксаки (в частности, A7, A9 и B5), и предварительные данные свидетельствуют о том, что они являются потенциальными терапевтическими агентами [38].

Целью данного исследования было испытание чувствительности опухолевых клеток глиобластомы к онколитическому действию ряда непатогенных онколитических энтеровирусов в моделях in vitro и in vivo с целью оценки перспектив использования этих вирусов в качестве терапевтических средств для лечения глиобластом.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Получение первичных клеточных культур из опухолей глиобластомы

Фрагменты свежеудаленных у пациентов опухолей хранили не более 12 ч в охлажденной стерильной культуральной среде. Кусочки опухоли механически отделяли от участков некроза, элементов стромы, кровеносных сосудов, и измельчали путем аккуратного продавливания через нейлоновую сетку с размером пор 50 мкм. Суспензию агрегатов опухолевых клеток промывали изотоническим
фосфатным буферным раствором (PBS) и инкубировали в 25 объемах раствора коллагеназы 4 (ПанЭко, Москва) в течение 25 мин при 30 °С. Для получения монослойных культур клеток глиобластомы обработанную коллагеназой суспензию дважды промывали средой DMEM (ПанЭко, Москва) и помещали в среду DMEM-F12, добавив 10% эмбриональной сыворотки теленка и по 100 мкг/мл пенициллина и стрептомицина при плотности 105 кл/мл. Планшеты инкубировали в атмосфере 5% СО2 при 37 °С с заменой среды через каждые 4 дня, до образования монослоев. Монослойные культуры устанавливали примерно через 18–25 дней инкубации на 10-сантиметровых культуральных чашках.

Рост опухолевых ксенотрансплантатов на иммунодефицитных мышах

Ксенотрансплантаты подкожных опухолей получали в результате инъекции нейросфер, образованных из глиобластом путем альтернативного способа высевания клеток после обработки фрагментов опухоли коллагеназой 4 (ПанЭко, Москва). Клетки высевали в плотности 104 кл./ мл в среду DMEM-F12 с добавлением по 100 мкг/мл пенициллина и стрептомицина, 20 нг/мл эпидермального фактора роста (EGF) и 10 нг/мл фактора роста фибробластов (bFGF). Культуры выдерживали в CO2-инкубаторе при 37 °C в течение 2 недель с заменой среды каждые 4 дня до появления видимых нейросфер. Нейросферы обогащены стволовыми клетками глиобластомы и обладают повышенной опухолегенной активностью при инъекции иммунодефицитным мышам. Для имплантации нейросферы дважды промывали PBS, подсчитывали с помощью гемоцитометра и по 200 нейросфер вводили подкожно в плечевую область 3–5-недельных бестимусных мышей линии Balb/c. Рост опухоли контролировали каждые 3 дня, а общее количество опухолей оценивали на 21-й день.

Штаммы онколитических вирусов

В работе использовали непатогенные штаммы энтеровирусов человека из коллекции лаборатории: полиовирус 1 типа (вакцинный штамм Сэбина), вирусы Коксаки A7 (штамм ЖЭВ8), Коксаки A9 (штамм ЖЭВ9) и Коксаки B5 (штамм ЖЭВ14) [38, 39]. Энтеровирусы выращивали в клетках Vero. Вирусные титры, выраженные как TCID50/мл, определяли путем инфицирования клеток Vero серийными разведениями вирусосодержащей жидкости.

Испытание чувствительности клеток глиобластом к вирусам

Для определения дифференциальной чувствительности к панели онколитических энтеровирусов опухолевых клеток, прошедших после эксплантации минимальное число пассирований в культуре, был использован опухолевый материал от двух пациентов с глиобластомами. Полученные от этих пациентов культуры обозначались как GM-3564 и GM-3876. Заражение культур проводили в 96-луночных планшетах для культивирования клеток (SPL Lifesciences, Республика Корея). Субконфлюэнтные однодневные монослои культур клеток GM-3564 и GM-3876, а также контрольных клеток Vero инкубировали с 0,1 мл серийных разведений вирусов. Спустя 7 ч после заражения культур серийными десятикратными разведениями вирусных препаратов, представляющих четыре непатогенных энтеровируса, определяли жизнеспособность клеток Цитопатическую активность оценивали через 72 ч с помощью набора реагентов для оценки жизнеспособности клеток (CellTiter- Glo® Luminescent Cell Viability Assay, Promega, США), согласно рекомендациям производителя.

Введение вируса in vivo

Для измерения способности вирусов предотвращать образование опухолей при введении нейросфер, перед подкожным введением нейросферы инкубировали с вирусами (2 × 106 инфекционных единиц (и.е.) вирусов в объеме 0,1 мл в течение 30 мин при 37 °C).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Полученные из опухолевого материала двух пациентов монослойные культуры глиобластом были испытывали на чувствительность к четырем штаммам энтеровирусов. Для клеток GM-3564 наиболее сильную литическую активность оказывал вирус Коксаки A7, несколько более слабую проявлял полиовирус 1 типа (рис. 1) В культуре GM-3876 наблюдали противоположную картину: в этих
клетках наиболее сильной инфицирующей и литической активностью обладал полиовирус 1 типа, тогда как вирус Коксаки A7 демонстрировал аналогичное действие только при дозах вируса, приблизительно в десять раз больших. Обе культуры были относительно устойчивы к действию вируса Коксаки В5 и почти полностью устойчивы к вирусу Коксаки A9. Этот последний штамм вируса оказывал небольшое токсическое действие только при максимальных дозах. Между тем, при инфицировании теми же дозами вирусов контрольной культуры клеток Vero все четыре вируса начинали оказывать цитотоксическое действие при примерно одинаковых дозах. Таким образом, две культуры глиобластом обладают явной селективностью в отношении их способности инфицироваться и лизироваться различными вирусными штаммами, что, по-видимому, обусловлено различием в их способности поддерживать репликацию этих вирусов.

Чтобы установить способность вирусных штаммов предотвращать образование подкожных опухолей при инъекции ксенотрансплантатов иммунодефицитным мышам, из опухолевого материала пациентов с глиобластомой получили культуры нейросфер. Нейросферы обогащены опухолеобразующими стволовыми клетками, и поэтому их опухолегенность значительно выше по сравнению с монослойными культурами клеток глиобластом. Чтобы получить культуры нейросфер, среда должна содержать специфические ростовые факторы EGF и bFGF. Кроме того, при получении нейросфер из фрагментов опухоли больного требуется произвести рассев в пластиковую посуду, не поддерживающую прикрепление клеток. В таких условиях клетки глиобластом образуют сфероидные агрегаты, или нейросферы, состоящие из многих клеток, причем нейросферы обогащенны опухолеобразующими стволовыми клетками. Поскольку подсчет числа отдельных клеток в сфероидах затруднен, для стандартизации процедуры подкожного введения с целью получения опухолей мы проводили подсчет самих нейросфер. В нашем предварительном исследовании было установлено, что введение 200 нейросфер воспроизводимо приводит к образованию опухолей в течение 1–2,5 недель. Контрольной группе из пяти мышей вводили подкожно в область плеча с обеих сторон по 200 нейросфер в объеме 0,5 мл. Такое же число мышей использовали при испытании влияния вирусов на опухолеобразование. Таким образом, в каждой группе мышей могло образовываться до 10 опухолей. Чтобы проверить способность вирусов предотвращать образование опухолей из инъецированных нейросфер, последние инкубировали с вирусами (см. «Материалы и методы»). Для каждого типа вирусов использовали пять мышей, которых инъецировали в две точки суспензией, содержащей обработанные вирусами нейросферы, и подсчет образовавшихся опухолей проводили через 21 день после инъекций. Оценка опухолей не включала измерение их размеров (рис. 2). В контрольной группе мышей, инъецированных нейросферами клеток GM-5564, образовалось 9 опухолей (из 10 возможных). Обработка полиовирусом 1 типа полностью подавляла образование опухолей, а после обработки вирусом Коксаки A7 появилась только одна опухоль, причем на более позднем сроке. После обработки вирусом Коксаки B5 образовалось три опухоли, а вирус Коксаки A9 практически не препятствовал формированию опухолей (8 опухолей). Принципиально похожие результаты мы наблюдали в группах мышей, которым вводили нейросферы клеток GM-3876: в контрольной группе образовалось 8 опухолей (из 10 возможных); после обработки полиовирусом и вирусом Коксаки A7 опухоли отсутствовали; в группе, обработанной вирусом Коксаки B5, появилось 4 опухоли, а вирусом Коксаки A9 — 8 опухолей.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Культуры нейросфер являются наиболее адекватной моделью для анализа терапевтического потенциала средств борьбы с глиобластомами [40]. Это объясняется тем, что нейросферы обогащены опухолевыми стволовыми клетками, которые служат основным источником рецидива заболевания вследствии их особой устойчивости к большинству терапевтических воздействий [41]. В данном исследовании мы провели анализ способности четырех непатогенных онколитических энтеровирусов предотвращать образование экспериментальных подхожных опухолевых ксенотрансплантатов, полученных при введении нейросфер, образовавшихся из опухолевого материала двух больных глиобластомой. Полученные данные указыват на высокий потенциал двух вирусных штаммов — полиовируса 1 типа и вируса Коксаки А7. Однако нейросферы от двух разных больных демонстрировали различную степерь чувствительности к этим вирусам, что указывает на необходимость персонифицированного подбора наиболее эффективных терапевтических штаммов после предварительного анализа биопсийного или операционного материала, полученного из опухолей пациентов. Недавно опубликованные результаты клинических испытаний рекомбинантного полиовируса PVSRIPO указывают на возможность длительных ремиссий у 21% больных глиобластомами, в то время как у остальных пациентов полиовирус не оказывал терапевтического действия [42]. Дополнение арсенала терапевтических штаммов вирусами, обладающими иными спектрами воздействия на опухоли, сможет существенно повысить процент случаев, поддающихся успешному лечению этого заболевания.

ВЫВОДЫ

По результатам проведенного исследования можно сделать вывод о том, что способность каждого из четырех штаммов непатогенных онколитических энтеровирусов оказывать цитолитическое действие в монослойных культурах клеток глиобластом человека хорошо коррелирует со способностью тех же штаммов предотвращать образование опухоли в результате ксенотрансплантации иммунодефицитным мышам. Таким образом, существует явная взаимосвязь между эффектами вирусов in vitro и их онколитической активностью in vivo. Кроме того, обнаружено, что вирусы, которые могут эффективно реплицироваться в монослойных культурах клеток глиобластом, способны эффективно убивать опухолеобразующие стволовые клетки глиобластом, что указывает на высокий потенциал онколитических вирусов в предотвращении рецидивов опухоли. Различия в чувствительности к вирусам опухолевых клеток, полученных от двух пациентов, указывают на необходимость персонифицированного подбора терапевтических штаммов.