В 2017 г. была принята Стратегия предупреждения распространения антимикробной резистентности в Российской Федерации на период до 2030 г, одной из задач которой является «Изучение механизмов возникновения антимикробной резистентности и разработка противомикробных препаратов и альтернативных методов, технологии и средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных заболевании человека, животных и растении».

В настоящее время по оценкам Всемирной организации здравоохранения за 2016 г. туберкулез, возбудителем которого является Mycobacterium tuberculosis, является основной причиной смертности от инфекционных заболеваний (1,8 млн человек) и инфицирования (10,4 млн человек) [1]. Основной проблемой, возникающей в борьбе с туберкулезом, является возникновение и распространение штаммов с множественной (МЛУ) и широкой (ШЛУ) лекарственной устойчивостью [2–4]. По статистике, МЛУ диагностируют в 4% новых случаев инфицирования и у 21% ранее прошедших лечение пациентов, а в России эти показатели составляют 22 и 53% соответственно. Разработка препаратов приводит к появлению новых механизмов резистентности. Помимо приобретенной, микобактерии обладают развитой системой природной лекарственной устойчивости, опосредованной наличием большого числа генов и генетических систем, объединенных в резистом. Концепция резистома была предложена в 2006 г. и подразумевает набор детерминант резистентности к антибиотикам, в том числе природную устойчивость, характерную для данного штамма бактерий, конкретного организма или экосистемы [5, 6]. Резистом M. tuberculosis включает гены, кодирующие белки различных классов: клеточные транспортеры, модификаторы мишеней и химической структуры лекарств, транскрипционные факторы ответа на стресс и ряд других.

Наряду с распространением лекарственноустойчивых форм большое значение имеет проблема возникновения сублиний бактерии M. tuberculosis, отличающихся повышенной вирулентностью [7–9]. Исследования с использованием лабораторных моделей in vitro (макрофаги) и in vivo (мыши) выявили наличие корреляции между вирулентностью и принадлежностью возбудителя к определенному генотипу [10]. В подавляющем большинстве случаев повышенную вирулентность демонстрируют бактерии линии (генотипа) Beijing, имеющей наиболее важное эпидемиологическое значение ввиду все большего распространения в мире и высокой частоты возникновения лекарственноустойчивых форм [11, 12]. Штаммы линии Beijing отличаются генетической неоднородностью, что привело к выделению ряда сублиний. Хотя в целом линии Beijing свойственна повышенная частота возникновения форм с повышенной вирулентностью и лекарственной устойчивостью, эти характеристики варьируют в зависимости от сублинии [13, 14]. Более того, различия в значимых с точки зрения клинической практики характеристиках могут наблюдаться даже у штаммов в составе одной сублинии.

Опыт последних десятилетий по изучению механизмов возникновения МЛУ/ШЛУ-фенотипа M. tuberculosis, создание активных в отношении таких штаммов антибиотиков, а также разработка профилактических и лечебных генно-инженерных вакцин и адъювантов к ним выявили ряд научных проблем [15]. Создание новых препаратов невозможно без понимания молекулярно-генетических механизмов возникновения и формирования лекарственной устойчивости и вирулентности.

Проблема лекарственной устойчивости и разработка новых противотуберкулезных антибиотиков

Помимо приобретенной лекарственной устойчивости существует природная лекарственная устойчивость, характеризующаяся низким (по сравнению с индуцированной) уровнем резистентности к антибиотикам. При воздействии антибактериального препарата на клетки M. tuberculosis у патогена активируются транскрипционные факторы, контролирующие экспрессию генов, чьи продукты способствуют модификации антибиотика или его мишени и обратному транспорту лекарственного вещества или его активных производных из бактериальной клетки. Гены, продукты экспрессии которых вовлечены в реализацию природной лекарственной устойчивости, служат мишенью для воздействия ряда факторов (включая сами антибиотики), что может приводить к изменению их экспрессии и, как следствие, к повышению уровня устойчивости бактерии.

Использование антибиотиков при лечении сопутствующих туберкулезу инфекционных заболеваний (или попадание антибиотиков в организм человека с продуктами питания) может способствовать повышению лекарственной устойчивости M. tuberculosis.

В 2015 г. пациентов, страдающих МЛУ- и ШЛУ- туберкулезом, насчитывалось более 580 000 человек. Столь широкое распространение эти штаммы получили в том числе из-за длительного применения одного и того же набора препаратов. Лишь недавно бедаквилин стал первым за последние 40 лет новым противотуберкулезным препаратом, применяемым в клинической практике [16].

В этой связи важной задачей становится разработка новых противотуберкулезных препаратов, к которым предъявляются следующие требования: высокая антимикобактериальная активность как в отношении лекарственно чувствительных штаммов M. tuberculosis, так и в отношении штаммов с МЛУ, а также специфичность к новой биомишени. На сегодняшний день разработкой новых противотуберкулезных препаратов, способных преодолеть феномен МЛУ/ШЛУ и/или сократить время противотуберкулезной химиотерапии, занимаются ведущие фармацевтические компании и исследовательские группы по всему миру, среди которых Lilly TB Drug Discovery Initiative, GSK, Roche, Sanofi, TB Alliance, Colorado State University и целый ряд других (http://www.newtbdrugs.org).

В России работы по созданию противотуберкулезных препаратов активно велись в рамках программы «Фарма-2020». Так, в Институте общей генетики имени Н. И. Вавилова (Москва) совместно со специалистами по медицинской химии из ряда научных и коммерческих организаций (ИОС УрО РАН, ФГБНУ «НИИНА», ФГБУН НИОХ СО РАН, ИОХ РАН, АНО «НИЦ «БИОАН», ООО «Новые научные технологии») были проведены и проводятся доклинические исследования противотуберкулезных препаратов новых химических классов: производных усниновой кислоты [17], замещенных азоло (1,2,4,5) тетразинов [18], аминопиридинов и аминопиримидинов [19], производных аминопуринов [20].

С наступлением постгеномной эры поиск противотуберкулезных средств проводится по двум векторам: от мишени к препарату и от препарата к мишени [21–23].

На первый подход возлагались большие надежды, однако они не оправдались в полной мере. Многие препараты, показавшие высокие ингибирующие свойства in vitro в отношении фермента-мишени, не проявляли активности in vitro на M. tuberculosis из-за неспособности проникнуть сквозь микобактериальную клеточную стенку, либо не были активными на моделях in vivo вследствие того, что выбранная мишень уже не была жизненно важной в этих условиях [22, 24].

Из успешных опытов такого рода стоит отметить эксперимент по отбору соединения BDM31343, ингибитора EtHR, супрессора EthA, который, в свою очередь, активирует этионамид [25]. Препарат повышал чувствительность микобактерий к этионамиду и усиливал в три раза его действие в мышиных моделях [26].

В связи с низкой эффективностью такого подхода наметилась тенденция к возврату к более традиционному пути поиска: от препарата к мишени, основанному на клеточном отборе [24]. Этим путем были обнаружены все ныне используемые противотуберкулезные препараты, включая бедаквилин, претоманид, деламанид, Q203, SQ-109 и BTZ043 [27].

При таком подходе, зачастую, прибегают к высокопроизводительному отбору на бактериальных культурах штамма M. tuberculosis H37Rv, а также родственных ему модельных штаммах M. bovis BCG и M. smegmatis [24, 28]. Поиск ведут на гигантских библиотеках химических соединений. Так, сотрудники компании GSK последовательным отбором на штаммах M. bovis BCG и M. tuberculosis H37Rv смогли отобрать из 2 млн соединений семь кандидатов в лекарства с высокой активностью, способностью проникать через клеточную стенку и низкой цитотоксичностью [29]. Подход «от препарата к мишени» сопряжен с необходимостью полногеномного секвенирования устойчивых к антибиотикам мутантов для обнаружения потенциальных биомишеней и проведения дальнейший исследований, направленных на подтверждение действия отобранных кандидатов в лекарственные препараты на эти потенциальные биомишени [24].

Глобальной задачей остается необходимость разработки препаратов, способных воздействовать на персистирующие формы M. tuberculosis. На сегодняшний день наиболее эффективным антибиотиком, способным поражать персистирующие клетки M. tuberculosis, является пиразинамид [30]. Устойчивость к пиразинамиду может сильно влиять на клинический прогноз, особенно в случае туберкулеза, вызванного МЛУ-формами бактерий [31, 32].

Разработка противотуберкулезных вакцин

Несмотря на то что вакцинация против возбудителя туберкулеза проводится повсеместно, заболеваемость остается аномально высокой. Это можно объяснить низкой эффективностью применяемой для глобальной иммунизации вакцины BCG (0–80% в зависимости от возраста, иммунного статуса, региона проживания вакцинируемых и т. д.) [33]. На эффективность вакцины влияет и генетическое разнообразие патогена. Существует предположение, что снижение эффективности вакцинации в отношении повсеместно распространенных штаммов линии Beijing может являться одним из объяснений успешности данной группы [11]. На этом фоне создание новой противотуберкулезной вакцины относится к числу наиболее приоритетных исследований.

В настоящее время разработка противотуберкулезных вакцин ведется по двум направлениям. Первым из них является создание вакцин на основе непосредственно микроорганизма (аттенуированного), являющегося возбудителем этого заболевания. В качестве одного из подходов используется создание нокаутных по различным генам мутантов M. tuberculosis. В их число входят гены, кодирующие различные факторы вирулентности: белки Mce (mammalian cell entry), способствующие инвазии патогена; белки PPE; белки, участвующие в биосинтезе липидов; сигма-факторы; двухкомпонентные системы и ряд других.

Второе направление, по которому ведется разработка противотуберкулезных препаратов, основано на использовании субъединичных вакцин, содержащих антигены возбудителей, полученные с использованием методов генной инженерии [34, 35]. К преимуществам таких вакцин относятся их высокая специфичность, меньшая аллергенность, простота производства и низкая себестоимость, удобство хранения и транспортировки [36].

В число белков — кандидатов для разработки вакцин нового поколения входят: секретируемые белки Ag85-комплекса, участвующие во взаимодействии с T-лимфоцитами, TB10.4 (rv0288), Hsp65, белки РЕ и РРЕ. Наиболее перспективными кандидатами считают белки систем секреции ESAT6 и CFP [36].

Однако, несмотря на значительный интерес к данной проблематике, разработка генно-инженерных вакцин не оправдала надежд. Главным недостатком таких вакцин стала их низкая иммуногенность.

При разработке генно-инженерных вакцин ключевой задачей является поиск оптимальных антигенов [36]. Высокую антигенность демонстрируют структурные элементы патогенности, которых у M. tuberculosis насчитывается более 300, и часть из них выбрана в качестве основы для разработки субъединичных вакцин [37]. Для многих из этих генов характерно наличие однонуклеотидного полиморфизма, приводящего к замене аминокислоты; такая замена может оказывать влияние на структуру белка-продукта, изменяя антигенную активность. В настоящее время при производстве генно-инженерных вакцин внутривидовое разнообразие M. tuberculosis не учитывается. Как правило используют последовательность генов стандартного лабораторного штамма H37Rv. При этом в отношении используемого для изготовления вакцин штамма M. bovis BCG установлено, что возникновение мутаций (вследствие микроэволюции при длительном культивировании) влияет на эффективность вакцины [38]. Не исключено, что антигенная активность белков у разных штаммов M. tuberculosis также различна.

Еще одним перспективным направлением представляется разработка кандидатной мукозальной вакцины против туберкулеза, индуцирующей формирование в первую очередь местного мукозального иммунитета. Важность индукции местного противотуберкулезного иммунитета показана в ряде работ, в которых интраназальное введение защитных IgA, предварительная обработка вирулентных M. tuberculosis защитными IgA или же интраназальное введение M. bovis BCG приводило к формированию эффективного ответа на инфицирование M. tuberculosis [39–42]. Применение мукозальной вакцины (отдельно или вместе с подкожной формой), могло бы решить проблемы, возникающие при BCG-вакцинации.

Стоит отметить, что к настоящему моменту ни одна из упомянутых выше новых противотуберкулезных вакцин не применяется в клинической практике. Как уже было сказано, недостатком таких вакцин является низкая иммуногенность, что обусловливает необходимость использования в составе вакцинных препаратов иммуноадъювантов.

Перспективы разработки адъювантов противотуберкулезных вакцин на основе штаммов пробиотиков

Под адъювантами подразумевают любые соединения, действующие неспецифично и повышающие иммунный ответ на вводимые вместе с ними антигены [43]. Из наиболее распространенных адъювантов можно выделить гидроксид алюминия и фосфат алюминия [44]. Однако для ряда антигенов адъювантный эффект этих соединений оказался недостаточным. К другим веществам, используемым в настоящее время в качестве адъювантов, можно отнести синтезируемый искусственно полиоксидоний и природный полисахарид хитозан. Кроме того, в качестве адъювантов испытывают различные компоненты клеток бактерий, которые содержат патогенассоциированные молекулярные паттерны (PAMP), запускающие иммунный ответ. В частности, описано адъювантное действие молочнокислых бактерий [45], компонентов бактериальной стенки [46, 47], фибронектинсвязывающего белка 1 Streptococcus pyogenes [48], поверхностных флагеллинов [49] и других.

Отдельные штаммы пробиотиков, в частности бифидобактерий, способны запускать продукцию Th17- и Th1-цитокинов [50], играющих важную роль в мукозальном иммунном ответе при туберкулезной инфекции [39]. Таким образом, интраназальное введение пробиотиков может оказать адъювантный эффект в отношении мукозальной противотуберкулезной вакцины с формированием протективного иммунитета к вирулентным штаммам M. tuberculosis. Как представители комменсальной микрофлоры бифидобактерии и лактобациллы способны стимулировать механизмы иммунной защиты, влияя на секрецию и провоспалительных, и противовоспалительных цитокинов. При исследовании иммуномодулирующей активности штаммов бактерий in vitro, как правило, используют культуры клеток кишечника (Caco-2, HT-29) или иммуноцитов (EC-6, THP-1). In vivo подобные эксперименты проводят на лабораторных животных (здоровых, с дефектами иммунной системы, гнотобионтах, а также имеющих экспериментальную инфекционную и неинфекционную патологию) [51, 52].

Следует отметить, что разные штаммы бифидо- и лактобацилл, а также их компоненты оказывают различный по степени выраженности иммуномодулирующий эффект [53–55]. Показано адъювантное действие лакто- и бифидобактерий при противовирусной вакцинации [56, 57], противострептококковой [58] и противоаллергической вакцинации [48, 59]. Введенные интраназально лактобациллы повышали местный мукозальный иммунитет, а также влияли на системные механизмы иммунной защиты, повышая устойчивость к заражению респираторно- синцитиальным вирусом [56, 57, 60] или вирусом гриппа. Представленные данные позволяют предположить, что применение интраназального введения пробиотиков в качестве адъювантов при вакцинации повысит эффективность формирования протективного мукозального иммунитета против M. tuberculosis.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

С момента появления человека M. tuberculosis присутствует в популяции как в активной, так и в латентной форме [61]. На примере штаммов линии Beijing, зародившейся на территории Китая около 7 тыс. лет назад и в настоящее время распространившейся по всему миру, можно наблюдать продолжающуюся эволюцию возбудителя туберкулеза через формирование новых молодых линий, таких как B0/W-148 (рисунок) [62, 63].

Показано, что на восприимчивость к возбудителю туберкулеза влияет уровень экспресии различных генов в T-лимфоцитах [64].

В связи с этим проблему формирования лекарственной устойчивости, увеличения вирулентности и разработки нового поколения противотуберкулезных препаратов следует рассматривать в контексте понятия «суперорганизм». Применение антибиотиков при противотуберкулезной терапии оказывает воздействие не только на патоген, но и на организм хозяина, что приводит, в числе прочего, к изменению состава кишечной микробиоты, и, как следствие, иммунитета, на который миробиота имеет непосредственное влияние. Прием антибиотиков влияет и на функционирование центральной и периферической нервных систем организма-хозяина, других систем и органов. Широкое применение антибиотиков в сельском хозяйстве ведет к их поступлению в продукты питания, что может приводить к формированию перекрестной лекарственной устойчивости. Кроме того, антибиотикотерапия при лечении микобактериозов может приводить к индукции латентного туберкулеза.

В целом можно констатировать, что основным фактором отбора при формировании лекарственноустойчивых вирулентноадаптированных форм M. tuberculosis в течение последних 60 лет является неконтролируемое применение антибиотиков. К числу других факторов можно отнести широкое распространение заболеваний, оказывающих влияние на иммунитет: ВИЧ, сахарный диабет 2-го типа, гепатит B и др. Определенное влияние оказывает изменение кишечной микробиоты, в связи со сменой диеты, усилением вследствии глобализации миграционных потоков и т. д. Генетическое разнообразие M. tuberculosis, обусловленное единичными нуклеотидными заменами (в первую очередь, в генах, определяющих вирулентность, природную лекарственную устойчивость, переход в персистирующее состояние), IS-элементами и, возможно, СRISPR-cas системами, тоже оказывает влияние на адаптацию патогена к организму хозяина [65, 66].

Успехи в области эпидемиологии, молекулярной генетики, сравнительной геномики, протеомики и системной биологии, достигнутые за последние годы при изучении M. tuberculosis, приводят к пониманию многофакторности вызываемого им заболевания, и, как результат, к необходимости применения персонализированного подхода при лечении туберкулеза.