По оценкам Всемирной организации здравоохранения, туберкулез является одной из главных причин смертности населения от бактериальных инфекционных заболеваний. За 2015 г. туберкулезом заболели 10,4 млн человек, в том числе 1 млн детей. До 60% всех новых случаев инфицирования приходится на Индию, Китай, Южную Африку (страны БРИКС), а также Пакистан, Индонезию и Нигерию [1]. Особую опасность представляют штаммы Mycobacterium tuberculosis, обладающие лекарственной устойчивостью (МЛУ, ШЛУ), доля которых среди возбудителей заболевания туберкулезом постоянно растет. Особо тревожная ситуация складывается в Индии, Китае и России (на эти страны приходится 45% от всех новых случаев выявления МЛУ-штаммов) [1–3].

В основном для выявления туберкулезной инфекции используют рентгенографический или флюорографический анализ, реже метод магнитно-резонансной томографии. Однако они позволяют выявить заболевание лишь на поздних стадиях. Кроме этих методов диагностики применяют микробиологические (посев на селективные среды с последующей микроскопией) и молекулярные (ПЦР, масс- спектрометрия, ИФА-γ, анализ липоарабиноманнана и другие) [4].

Помимо лекарственной устойчивости эпидемиологически опасной особенностью туберкулезной инфекции является фактор вирулентности [5]. Показано, что представители разных филогенетических линий M. tuberculosis обладают различной способностью заражать людей. Так, штаммы самой распространенной и «успешной» линии Beijing имеют повышенную вирулентность, а представители филогенетической линии LAM–KZN, характерной для Южной Африки, с высокой специфичностью поражают людей с иммунодефицитом, вызывая быстро наступающую смерть [6–8].

По предварительным оценкам, на сегодняшний день в РФ до половины изолятов, выделенных у первично обратившихся пациентов, представлены бактериями линии Beijing-B0. Линия характеризуется отсутствием лекарственно чувствительных штаммов и повышенной вирулентностью. Схожая ситуация наблюдается для линий LAM-KZN в ЮАР и Beijing-modern в Китае. Стоит отметить, что все три перечисленные линии очень молоды и возникли в последние 50–60 лет — эру применения антибиотиков [2, 9]. Существует гипотеза, что мутации в генах — мишенях антибиотиков оказывают положительный эффект и на природную лекарственную устойчивость, и на связанную с ней вирулентность [3].

Таким образом, особенно актуальны исследования, выявляющие возможности предупреждения развития эпидемий, вызванных «молодыми» линиями микобактерий туберкулеза, а также повышения эффективности противотуберкулезной терапии за счет обнаружения новых, более приспособленных, линий M. tuberculosis путем определения мутаций, ассоциированных с развитием лекарственной устойчивости и вирулентности [10]. Целью исследования было провести анализ тяжести протекания туберкулезной инфекции у пациентов с различным состоянием иммуной системы при инфицировании M. tuberculosis Beijing-B0. Для решения поставленной задачи необходимо было провести сбор и анализ клинических изолятов M. tuberculosis с учетом характеристик клинического проявления туберкулезной инфекции, а также определить иммуннокомпрометацию пациентов с «опасными» формами туберкулеза. Помимо стандартного набора показателей для пациентов [11] и данных о лекарственной устойчивости M. tuberculosis, необходимо было учесть и иммунный статус пациента.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Бактериальные штаммы и микробиологические среды

В работе использовали коллекцию клинических изолятов M. tuberculosis, принадлежащую отделению микробиологии и ПЦР-диагностики Национального медицинского исследовательского центра фтизиопульмонологии и инфекционных заболеваний (Екатеринбург). Культивирование культуры M. tuberculosis производили на твердой питательной среде Левенштейна–Йенсена и/или Новая (BioMedia, Россия).

Генотипирование клинических изолятов M. tuberculosis

Принадлежность изолятов к генотипу Beijing-B0/W148 определяли согласно рекомендациям [2]. Выделение ДНК проводили с использованием наборов «Проба НК» (ДНК- Технология, Россия) согласно инструкции производителя. Выделенную ДНК использовали для MIRU-VNTR- генотипирования с помощью коммерческого набора реагентов «ТБ-ТЕСТ» (БИОЧИП–ИМБ, Россия) согласно инструкции производителя. Продукты амплификации разделяли в 1,5% агарозном геле с окрашиванием бромистым этидием. Наличие ПЦР продукта длинной 1018 п.н. свидетельствовало о принадлежности изолята к генотипу Beijing-B0/W148.

Определение лекарственной чувствительности M. tuberculosis

Определение чувствительности к противотуберкулезным препаратам осуществляли методом абсолютных концентраций. Для этого по 0,2 мл суспензии исследуемой культуры, содержащей 10 млн бактериальных клеток, засевали в пробирки с твердой средой Левенштейна–Йенсена без препаратов (контроль) или с содержанием (по отдельности) противотуберкулезных препаратов в следующих концентрациях: 1 мкг/мл изониазида; 40 мкг/мл рифампицина; 2 мкг/мл этамбутола; 30 мкг/мл канамицина, 30 мкг/мл капреомицина; 1 мкг/мл парааминосалициловой кислоты; 30 мкг/мл циклосерина; 30 мкг/мл протионамида; 2 мкг/мл офлоксацина. Культуру M. tuberculosis считали чувствительной, если в пробирке со средой, содержащей препарат, вырастало менее 20 колоний. При наличии более 20 колоний изолят считали устойчивым (резистентным) к той концентрации препарата, которая была в среде.

Пациенты — источники клинических изолятов

В работе использовали данные анамнезов и результаты клинических исследований периферической крови пациентов, проходивших лечение в Уральском научно- исследовательском институте фтизиопульмонологии (Екатеринбург). Для проведения исследования было получено разрешение местного этического коммитета (протокол №59 от 14.11.2017) и отобраны данные совершеннолетних пациентов с впервые выявленным туберкулезом. Все пациенты были разделены на две группы: в 1-ю группу вошли пациенты с иммунокомпрометацией, во 2-ю группу — пациенты без иммунокомпрометирующих состояний. Критериями включения в 1-ю группу (66 человек) были наличие инфицирования M. tuberculosis Beijing-B0, инфицирование вирусом гепатита B (ВГВ), гепатита С (ВГС), вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), наличие иммунодепрессивного синдром (ИДС), аллергии, лимфопролиферативных заболеваний, онкологических заболеваний, ревматоидного артрита, сахарного диабета, хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ); критерии включения во 2-ю группу (34 человека): наличие инфицирования M. tuberculosis Beijing-B0, отсутствие иммунокомпроментирующих состояний. Критерии исключения: несовершеннолетние пациенты, пациенты со вторичным туберкулезом.

Методы статистического анализа

Статистический анализ различий был осуществлен с использованием критерия хи-квадрат (χ²) с последующей оценкой р-значения (p < 0.05). Для расчета значений критерия χ² была использована программная среда R (R software v. 3.5.1).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Формирование коллекции клинических изолятов

Для поиска мутаций в генах вирулентности, потенциально ассоциированных с лекарственной устойчивостью M. tuberculosis, была составлена выборка клинических изолятов, выделенных от больных туберкулезом пациентов. Для анализа принадлежности изолятов M. tuberculosis к филогенетической линии Beijing-B0 было проведено MIRU-VNTR-генотипирование. По результатам анализа профиля было отобрано 100 изолятов M. tuberculosis, принадлежащих к генотипу Beijing-B0/W148.

Для каждого исследуемого изолята был также проведен тест на лекарственную чувствительность с использованием метода абсолютных концентраций. Множественная лекарственная устойчивость (МЛУ), т. е. устойчивость, по меньшей мере, к рифампицину и изониазиду выявлена у всех 100 изолятов. МЛУ+-фенотип (устойчивость к рифампицину, изониазиду и дополнительно устойчивость к фторхинолонам или аминогликозидам/полипептидам) выявлен у 69 изолятов.

Характеристика клинических предикторов иммунных дисфункций

Помимо определения лекарственной чувствительности отобранных изолятов микобактерий туберкулеза был проведен анализ иммуннокомпрометации и клинической картины заболевания пациента — источника изолята с учетом анамнеза пациентов и лабораторных показателей крови. Среди факторов, определяющих обратимость дисфункции иммунной системы, выделяют такие, как голодание или дефицит жизненно важных пищевых компонентов, болезни метаболизма (сахарный диабет, метаболический синдром), психическая депрессия и временный дистресс любой природы. В дополнение к этому, более глубокие нарушения функционирования иммунной системы способны вызывать: инфекции, ионизирующая радиация, химические вещества с лимфотоксическим действием и лимфопролиферативные заболевания [12]. В ходе исследования были изучены предикторы, способные запустить и/или постоянно поддерживать напряжение иммунной системы (табл. 1).

Таким образом, развитие туберкулеза возможно не только вследствие контакта с больным туберкулезом, но и по эндогенному сценарию за счет активации микобактерий туберкулеза (МБТ), находящихся в организме в течение многих лет (латентная инфекция). На основании наличия или отсутствия иммунокомпрометации пациенты были разделены на две группы.

При ко-инфекции (ВИЧ + ТБ) давность заболевания у пациентов зафиксирована в сроки от 1 месяца (когда одновременно с заболеванием туберкулезом пациент узнал о наличии ВИЧ) до 13 лет наблюдения у инфекционистов, предшествовавшего возникновению ТБ (в среднем 37,5 ± 50,5 месяца). Уровень вирусной нагрузки был неопределяемым у 3 человек, получавших антиретровирусную терапию (АРВ-терапию). Вирусная нагрузка у лиц, инфицированных ВИЧ, составляла от н/о (не определяется) до 1 млн (0,22 ± 0,35 млн) копий в 1 мл, а количество CD4-лимфоцитов было от 148 до 1060 (611 ± 380) кл./мл (16,0 ± 12,3%).

Клиническая характеристика туберкулезной инфекции

Известно, что развитие туберкулеза происходит, как правило, в иммунокомпрометированном организме. В нашем исследовании пациентов, имеющих заболевания, оказывающие негативное действие на функцию иммунной системы, насчитывалось в 2 раза больше, чем лиц без них (66 против 34 человек). Несмотря на наличие клинических признаков иммунной недостаточности, проявления туберкулезной инфекции в обеих группах были однотипными (табл. 2).

В обеих группах в большинстве случаев пациенты имели инфильтративную форму туберкулеза. В первой группе несколько реже встречалась диссеминированная форма, но достоверных отличий не зафиксировано (р > 0,05). Отмечено, что внелёгочные формы регистрировались только у пациентов первой группы, что могло быть отражением степени иммунокомпрометации этих пациентов.

В табл. 3 представлены фазы туберкулезной инфекции у пациентов, включенных в исследование.

Поиск статистически значимых различий между исследуемыми группами был осуществлен с использованием критерия χ². Результаты теста, представленные в табл. 3, свидетельствуют об отсутствии достоверных различий в частоте регистрации фаз специфического воспаления между выделенными группами (p > 0,05 для всех групп).

Лабораторные показатели, характеризующие состояние иммунной системы

Наряду с клиническими проявлениями имеются лабораторные признаки иммунных дисфункций (табл. 4). На основании отклонений в показателях можно предположить наличие иммунной недостаточности [13].

В обеих группах характеризующие функцию фагоцитарной системы показатели (количество нейтрофилов и моноцитов) не различались (табл. 4). При изучении количества лимфоцитов, отражающих состояние клеточного звена иммунитета, достоверных различий не выявлено. Исследуя количество эозинофилов, мы обратили внимание на превышающее среднее значение стандартное отклонение, что означает наличие существенной разнородности внутри группы. Высокая разнородность группы позволяет предположить, что у пациентов первой группы эозинофилия появлялась не только вследствие аллергической реакции на лекарственные препараты, но и как проявление сопутствующей аллергопатологии паразитарной инвазии. В то же время, во второй группе причиной были исключительно аллергические реакции на лекарства, возникающие в любом организме, в том числе без иммунокомпрометации. Уровень СОЭ свидетельствовал об отсутствии различий между группами в отношении гуморального звена иммунитета.

Предположение, высказанное в отношении гуморального звена иммунитета на основании показателя СОЭ (табл. 4), подтвердилось данными о концентрации глобулинов (табл. 5). Данная фракция отражает количество иммуноглобулинов, определяющих уровень этого показателя. Синтез глобулинов не имел достоверных отличий у пациентов разных групп. Показатели концентрации глюкозы имели некоторые различия внутри первой группы за счет наличия в ней пациентов с сахарным диабетом. В то же время, во второй группе существенных различий внутри группы не зафиксировано, о чем свидетельствует небольшое значение стандартного отклонения. Уровни синтеза альбумина и общего белка не имели различий у пациентов разных групп.

ОБУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Для поиска особенностей протекания туберкулеза, вызванного МБТ линии Beijing-B0 нами была сделана выборка пациентов, охарактеризованных по анамнезу, наличию или отсутствию предикторов иммунной дисфункции (ВГВ и ВГС, ВИЧ, ИДС, аллергии, лимфопролиферативные заболевания, онкологические заболевания, ревматоидный артрит, сахарный диабет, ХОБЛ), а также составлена краткая иммунограмма для каждого из пациентов. Формирование такой выборки необходимо для более детального и качественного анализа особенностей протекания туберкулеза, вызванного Beijing-B0 [6], а также позволяет при проведении дальнейших сравнительных геномных исследований выявлять ключевые маркеры (мутации) у изолятов M. tuberculosis способствующие успешности данной линии инфицировать иммунокомпрометированных людей. Учитывание многочисленных показателей является критически важным, так как упущение или отсутствие каких-либо данных о пациенте-источнике может привести к недостоверности результатов либо к их бесперспективности [14, 15]. Так, сформированная коллекция из 1000 изолятов M. tuberculosis, выделенных в Самаре, не была достаточно подробно охарактеризована, что привело к невозможности продолжения начатой работы [11].

Помимо сбора и писания выборки пациентов — источников клинических изолятов M. tuberculosis Beijing-B0 нами был проведен анализ различий характеристик инфекционного процесса и лабораторных показателей между пациентами групп, отличающихся по наличию факторов, влияющих на состояние иммунной системы; при разных стартовых состояниях иммунной системы клинические формы туберкулезного процесса имеют схожие черты. Нами не было выявлено существенного влияния туберкулеза, вызванного M. tuberculosis Beijing-B0, на клиническую картину проявления сопутствующего заболевания, а также связи показателей иммунограммы пациента, кроме тех случаев, когда были обнаружены существенные различия в характере протекания туберкулеза (только при иммунокомпрометации сильной степени, например при числе CD4⁺-лимфоцитов менее 200 кл./мл). На сегодняшний день представлен ряд исследований, демонстрирующих на молекулярном уровне [9, 10, 16], а также на животных моделях особую опасность (патогенность) штаммов данной линии [17, 18]. Возможно, что проведение полногеномного секвенирования, анализа мутаций генов вирулентности и патогенности позволит получить четкий ответ на вопрос об «опасности» данной филогенетической линии M. tuberculosis и связи с иммунным состоянием организма человека.

ВЫВОДЫ

Представлена проанализированная по спектру лекарственной устойчивости и пациенту-источнику выборка из 100 клинических изолятов M. tuberculosis Beijing-B0. Для каждого образца определены иммунокомпрометирующие состояния и сформирована иммунограмма. Данный подход представляется ключевым для проведения высококачественных геномных исследований, направленных на борьбу с эпидемией, вызванной вирулентным и лекарственно-устойчивым возбудителем туберкулеза.

На сегодняшний день не существует единого формата паспортизации клинических изолятов M. tuberculosis, особенно в геномных и филогенетических исследованиях. В работе не только создан паспорт для каждого изолята, но и добавлена информация о пациенте-источнике. Были собраны данные об иммунокомпрометации, состоянии крови пациента (иммунограмма), анамнез пациента. Сформированная коллекция позволит проводить более качественные и всеобъемлющие геномные исследования, а также проводить поиск взаимосвязи между иммунным статусом пациента и генотипом M. tuberculosis.