Присутствие ДНК в плазме и сыворотке крови было обнаружено в 1948 г. еще до открытия структурной формулы этой молекулы [1]. ДНК, присутствующая в крови в составе плазмы (сыворотки), получила название циркулирующей или внеклеточной ДНК (вкДНК) [2]. В 1997 г. впервые было показано наличие циркулирующей вкДНК эмбриона в плазме крови беременной женщины [3]. Обнаружение эмбриональной вкДНК в материнской плазме и сыворотке привело к созданию нетравматичных методов пренатальной диагностики, направленных на обнаружение генетической патологии эмбриона [4]. В настоящее время разработаны методы, позволяющие провести полногеномный анализ ДНК плода в составе вкДНК плазмы матери [5].

Помимо анализа генетических аномалий плода, анализ вкДНК позволяет проводить мониторинг связанных с беременностью осложнений, таких как преэклампсия и невынашивание беременности [6–8]. В этом случае определяют не конкретный мутантный ген, а общую концентрацию вкДНК материнской крови или отдельно вкДНК плода. Основным источником вкДНК плода в крови матери считают гибнущие в результате некроза и/или апоптоза клетки плаценты [9].

Необходимо отметить, что при измерении концентрации вкДНК в плазме крови беременных женщин исследователи не учитывают процессы, направленные на снижение концентрации вкДНК в кровотоке. Увеличение количества вкДНК в крови вследствие роста в организме уровня гибели клеток приводит к активации компонентов системы элиминации вкДНК из кровотока и последующему снижению концентрации вкДНК. Эффект значительного снижения концентрации вкДНК на фоне хронических процессов, сопровождающихся усиленной гибелью клеток организма, мы наблюдали ранее у пациентов с хронической сердечно-сосудистой патологией [10] и лиц, длительное время работающих в условиях повышенного радиационного фона [11].

Ранее нами были исследованы совместные изменения концентрации вкДНК и активности одного из компонентов системы элиминации вкДНК из кровотока — фермента ДНКазы I в плазме крови небеременных женщин и женщин с нормальной и осложненной беременностью [12]. Поскольку в этой работе были получены нестандартные результаты: 1) уровень вкДНК у женщин с нормальной и патологической беременностью не превышал соответствующий показатель в группе контроля (согласно современным литературным данным при нормальной и патологической беременности он резко повышается [13]); 2) обнаружено двукратное повышение эндонуклеазной активности у женщин с патологией беременности (этот феномен был описан впервые), было решено провести повторное исследование, в котором повышенное внимание уделялось бы клиническим параметрам здоровых и беременных женщин.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

В исследовании принимали участие 115 женщин в возрасте 22–40 лет (средний возраст 32 ± 4 года), проживающие в г. Москве (РФ) в одинаковых социальных условиях. В зависимости от групп, критерии включения варьировались: в группу 1 вошли практически здоровые небеременные женщины (n = 40), представленные студентками и ординаторами медицинского учреждения (волонтеры); группа 2 — женщины с нормально протекающей беременностью (срок гестации более 37 недель; n = 40) без какой-либо выявленной патологии, родившие здоровых детей без признаков гипоксии и гипотрофии; группа 3 — женщины с проблемной беременностью, с клиническими диагнозами невынашивания, плацентарной недостаточности, внутриутробной задержки роста плода (ВЗРП), хронической гипоксии плода, наличием несостоятельного рубца на матке (срок гестации более 30 недель, n = 35). Критерии исключения не применялись. Забор крови у здоровых небеременных женщин осуществляли между 10 и 15 днем менструального цикла. Запланированное в рамках кандидатской диссертации исследование было одобрено этическим комитетом Российского национального исследовательского медицинского университета им. Н. И. Пирогова (протокол № 159 от 21.11.2016). Всеми участницами исследования было подписано добровольное информированное согласие.

Диагностика развития плода

Динамику роста плода во время беременности определяли с помощью ультразвуковой антропометрии: измеряли бипариетальный размер головки, диаметры груди и живота и длину бедренной кости. При отставании этих размеров от указанных в литературе среднепопуляционных значений [14] на 2 недели ставили диагноз ВЗРП I степени, при отставании на 2–4 недели — ВЗРП II степени и более 4 недель — ВЗРП III степени. Окончательный диагноз ВЗРП устанавливали после родов на основании данных массы плода. Нормативные параметры находились между 75 и 25 перцентильными кривыми, I степень ВЗРП соответствовала 25–10 кривой. II степень — 10–3 кривой, III степень — ниже 3 кривой [15]. Использовали также массо-ростовой коэффициент новорожденных: норма — выше 60, ВЗРП I степени — 55–60, II степени — 50–55, III степени — ниже 50. Функциональное состояние плода во время беременности и родов оценивали с помощью методов функциональной диагностики: кардиотокографии (КТГ) и допплерометрии сосудов матки, пуповины и плода. Ультразвуковые исследования (УЗИ) проводили на аппарате Voluson 530 MT (Kretztechnik; Австрия), Voluson Е8 (General Electric; США) с использованием датчиков RIC 5–9 D (4–9 МГц), С1–5D (2–5 МГц), RAB 4–8 D (2–8 МГц); КТГ — с помощью фетального монитора (GЕ Corometrics (250CX); США).

Специальные исследования

Выделение фрагментов циркулирующей вкДНК из 1 мл гепаринизированной плазмы крови проводили методом фенольной экстракции. Клетки крови осаждали центрифугированием при 400 g в течение 10 мин, полученную плазму смешивали с 10% лаурилсаркозилатом натрия, 0,2 M EDTA и стандартным раствором РНКазы с концентрацией 0,075 мг/мл (Sigma; USA), затем инкубировали в течение 45 мин и обработывали стандартным раствором протеинкиназы К 0,2 мг/мл (Promega; USA) в течение 24 ч при 37 °C. После двух циклов отмывания с насыщенным фенольным раствором фрагменты ДНК осаждали добавлением двух объемов этанола в присутствии 2 M ацетата аммония. Затем осадок дважды отмывали добавлением 75% этанола, высушивали и растворяли в воде. Для определения концентрации вкДНК применяли флуоресцирующий краситель Pico Green (Sigma; США). Флуоресценцию регистрировали на приборе LS-55 (Perkin Elmer; США).

Активность ДНКазы 1 определяли по ранее разработанной методике [16]. Cубстрат для ДНКазы 1 (Синтол; Россия) представляет собой двухцепочечный олигодезоксирибонуклеотид длиной 30 звеньев состава R6G – ACC CCC AGC GAT TAT CCA AGC GGG – BHQ1. Последовательность модельного субстрата не имеет особого значения. На 5′-конце олигонуклеотид содержит флуоресцентную группу (5(6)-карбоксиродамин), на 3′-конце — тушитель флуоресценции (BHQ1). При эндонуклеазном гидролизе наблюдается увеличение флуоресценции красителя. 10 мкл образца плазмы крови добавляли к 90 мкл раствора для ДНКазы 1 (10 мM HEPES, pH 7,5, 20 мM MgCl2, 5 мM CaCl2), который содержал 3 пикоМ олигонуклеотида-субстрата. Реакцию проводили при 37 °С в течение 1 ч, регистрировали изменение сигнала флуоресценции красителя с помощью планшетного ридера (EnSpire; Финляндия). Для расчета активности ДНКазы 1 получали калибровочную прямую, которая связывает величину разгорания флуоресценции красителя с концентрацией стандартного образца ДНКазы 1 (Сигма; США) в растворе. Единица активности: 1 ед., равная 1 нг/мл, соответствует активности ДНКазы 1 (увеличение флуоресценции субстрата), взятой в концентрации 1 нг/ мл (1 ч, 37 °С). Проводили не менее трех параллельных измерений для одного образца. Относительная стандартная ошибка метода — 5%.

Статистическую обработку результатов проводили с применением критерия Манна–Уитни, с помощью программы «StatPlus 2007» (Statistical Graphics Corp.; США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Проведенные исследования показали, что во 2-й группе наблюдений (женщины с нормально протекающей беременностью) сердечная деятельность плода по шкале Фишера оценивалась от 7 до 10 баллов, объемный кровоток в аорте составлял от 180 до 260 мл/мин, в вене пуповины от 86 до 140 мл/мин на 1 кг массы плода. В 3-й группе в 28 из 35 наблюдений было зарегистрировано снижение функционального состояния плода по шкале Фишера до 4–7 баллов, объемный кровоток в аорте плода достигал 120–174 мл/мин, в вене пуповины 60–86 мл/мин на 1 кг. Характеристика пациенток с ВЗРП I–III степени тяжести представлена в табл. 1. Наиболее значительные изменения функционального состояния плода были зарегистрированы у пациенток при гипотрофии II и III степени. Нарушение кровотока у пациенток с ВЗРП II степени характеризовалось нарушениями маточно- плацентарного и плодо-плацентарного кровотока. При ВЗРП III степени регистрировались нарушения плодо- плацентарного кровотока: нулевой или реверсивный диастолический кровоток в артерии пуповины или аорте, нарушение маточного кровотока. У пациенток с ВЗРП II и III степени были зарегистрированы снижение функционального состояния плода (ниже 7 баллов по шкале Фишера), нулевой или реверсивный диастолический кровоток в артерии пуповины или аорте, нарушение маточного кровотока.

Концентрация вкДНК у здоровых небеременных женщин (табл. 2) варьировала в пределах 11–123 нг/мл (медиана 75,5 нг/мл), при нормальной беременности — в пределах 2–347 нг/мл (медиана 78 нг/мл) и в случае беременности с ВЗРП — в пределах 1,2–595,7 нг/мл (медиана 42,1 нг/мл). Согласно критерию Манна–Уитни группы не различаются достоверно между собой (p > 0,05). Можно отметить, что во 2-й и в 3-й группах у 9 образцов (22,5%) концентрации вкДНК превышали верхнюю границу для небеременных женщин (123 нг/мл). Обращает на себя внимание факт значительного разброса данных у беременных по сравнению с небеременными женщинами. Так, коэффициенты вариации изменялись в ряду: 0,42 (группа 1); 0,87 (группа 2); 1,37 (группа 3).

Основной причиной снижения концентрации вкДНК может быть повышение активности компонентов системы элиминации вкДНК из кровотока. Одним из факторов, влияющих на элиминацию вкДНК, является активность в плазме крови ДНКазы I, отвечающей за гидролиз вкДНК. У небеременных женщин активность этого фермента в плазме крови (табл. 2) варьировала в пределах 1,1–5,9 IU/мл (медиана 3 IU/мл ), при нормальной беременности — в пределах 0,6–14,8 IU/мл (медиана 3,4 IU/мл) и в случае беременности с ВЗРП — в пределах 3,9–14,3 IU/мл (медиана 6,3 IU/мл). Согласно критерию Манна–Уитни группы 1 и 2 не различаются достоверно между собой (p > 0,05). Однако группа пациенток с осложненной беременностью статистически значимо отличается от группы здоровых небеременных женщин (p < 10–7) и группы женщин с нормально протекающей беременностью (p < 10–5) по показателю активности ДНКазы I в плазме. Таким образом, плазма крови беременных с диагностированной ВЗРП характеризуется высокими значениями активности ДНКазы I, по сравнению с соответствующими показателями у женщин с нормально протекающей беременностью и у небеременных женщин. У 18 из 35 (51,4%) беременных женщин из группы 3 были отмечены высокие значения активности ДНКазы I, которые не встречались в группе небеременных здровых женщин. В группе 2 повышенные значения активности ДНКазы I обнаружены только у 4 из 40 (10%) беременных (р = 0,0002, согласно критерию Фишера).

В табл. 3 представлены результаты исследования корреляционной зависимости между концентрацией вкДНК и уровнем активности ДНКазы I. В группе здоровых небеременных женщин была выявлена умеренно выраженная, но статистически значимая отрицательная корреляционная связь между этими показателями (R = 0,37; p < 0,05). У беременных женщин (особенно с осложненной беременностью) концентрация вкДНК и уровень активности ДНКазы I слабо коррелировали между собой.

При сравнении показателей пациенток с ВЗРП различной степени тяжести статистически значимых различий между подгруппами обнаружено не было. Однако концентрация вкДНК и интегративный показатель вкДНК/ ДНКаза I обнаруживали стойкую тенденцию к повышению в соответствии со степенью тяжести ВЗРП (табл. 4). Анализ индивидуальных параметров показал, что только у 4 из 24 (16,7%) пациенток с ВЗРП I и II степени тяжести были отмечены высокие значения концентрации вкДНК, не встречавшиеся в группе небеременных здоровых женщин, в то время как в группе женщин с ВЗРП III степени тяжести таких пациенток было 6 из 11 (54,5%; p = 0,0413, согласно критерию Фишера). Более того, при сопоставлении интегративного показателя вкДНК/ДНКаза I у пациенток с различной степенью ВЗРП с соответствующими параметрами в группах контроля статистически значимые различия были обнаружены только для пациенток с ВЗРП I–II степени тяжести (в обоих случаях р < 0,001). У пациенток с ВЗРП III степени соотношение вкДНК/ДНКаза I существенно не отличалось от таковых в группах здоровых небеременных и беременных женщин (табл. 2, табл. 4).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Уровень материнской вкДНК высоко коррелирует с количеством вкДНК плацентарного происхождения [17]. В настоящее время известно, что только небольшое количество вкДНК матери попадает в кровоток из солидных органов, таких как печень или почки, большая часть вкДНК имеет гематопоэтическое происхождение. В частности, стабильным источником низкомолекулярной фрагментированной вкДНК могут быть дифференцирующиеся эритробласты. Быстрый подъем уровня вкДНК в циркуляции при патологических процессах и физической нагрузке происходит в результате активации нейтрофилов, выбрасывающих в качестве «ловушек» сети ядерной и/или митохондриальной ДНК [18].

ВкДНК воздействует на многие клетки организма. Циркулирующая ДНК может усилить окислительный стресс, стимулировать синтез провоспалительных цитокинов и индуцировать асептическое воспаление [19]. Сети вкДНК, выбрасываемые активированными нейтрофилами, привлекают большое количество тромбоцитов и существенно повышают риск тромбообразования [18]. Организм защищается от негативного действия избыточных количеств вкДНК путем активации системы элиминации вкДНК из кровотока. Одним из компонентов системы элиминации вкДНК является эндонуклеазная активность крови. Основная эндонуклеаза крови, ДНКаза I, гидролизуюет фосфодиэфирные связи в цепях ДНК. Накопление в цепях одноцепочечных разрывов приводит к возникновению двухцепочечных разрывов и снижению молекулярного веса фрагментов вкДНК. Низкомолекулярные фрагменты вкДНК могут элиминироваться путем почечной фильтрации. У здоровых небеременных женщин мы обнаружили умеренно выраженную, но статистически значимую отрицательную корреляцию между количеством вкДНК в плазме и активностью ДНКазы I. По-видимому, активность этого фермента в данном случае служит основным фактором, ответственным за вывод фрагментов вкДНК из кровотока. У женщин с нормально протекающей беременностью и у пациенток с ВЗРП корреляции между уровнем вкДНК и активностью ДНКазы I обнаружено не было.

При патологии плаценты происходит активация апоптотических процессов в трофобласте, что сопровождается повышением в кровотоке матери концентрации микровезикул, содержащих плацентарную вкДНК. Микровезикулы трофобласта, в свою очередь, стимулируют выброс нейтрофилами нитей ядерной и/ или митохондриальной ДНК (нетоз). Таким образом, при осложненной беременности следует ожидать значительного увеличения общей концентрации вкДНК в плазме крови матери. В данном исследовании нам не удалось выявить повышения уровня суммарной вкДНК у беременных женщин с ВЗРП. Более того, концентрация вкДНК в плазме пациенток с осложненной беременностью была даже ниже (статистически незначимо), чем соответствующий показатель в плазме здоровых беременных и небеременных женщин. В то же время мы обнаружили достоверное увеличение активности ДНКазы I в плазме беременных женщин с ВЗРП, что косвенно свидетельствует о транзиторном повышении уровня циркулирующей вкДНК у пациенток с осложненной беременностью. Можно предположить, что при ВЗРП значительное увеличение общей концентрации вкДНК в плазме матери активирует защитные механизмы (в том числе ДНКазу I), способствующие элиминации избыточных количеств вкДНК из кровотока. У большинства пациенток с ВЗРП I и II степени тяжести умеренные нарушения плацентарного кровотока (табл. 1) приводят к умеренному и, возможно, транзиторному повышению уровня вкДНК, которая быстро выводится из кровотока активированной ДНКазой I. У таких пациенток можно обнаружить низкие концентрации вкДНК, высокоактивную ДНКазу I и низкое значение показателя «вкДНК/активность ДНКазы I». У большинства пациенток с ВЗРП III степени происходит быстрое накопление вкДНК в плазме, с которым не справляются механизмы элиминации. У таких пациенток можно обнаружить повышенные концентрации вкДНК, высокоактивную ДНКазу I и высокий показатель «вкДНК/ активность ДНКазы I». При этом избыток вкДНК в циркуляции усугубляет нарушения плацентарного кровотока и повышает риск неблагоприятного исхода беременности.

Полученные результаты показывают, что высокий уровень активности системы элиминации вкДНК затрудняет и искажает результаты анализа концентрации вкДНК при беременности, особенно при патологии. Видимо поэтому, литературные данные об изменении концентрации вкДНК при патологии беременности столь противоречивы. Однако, если учитывать три показателя — концентрацию вкДНК, активность ДНКазы I и отношение вкДНК/ДНКаза I, то в перспективе можно разработать систему мониторинга уровня гибели клеток в организме беременной на протяжении всей беременности (например, один раз в три месяца). Эти показатели дают информацию об уровне гибели клеток и об эффективности работы системы элиминации, которая включает ДНКазу I и другие значимые при беременности компоненты. Так, если при мониторинге на определенной неделе беременности имеет место усиление активности ДНКазы I на фоне относительно высоких показателей концентрации вкДНК, то можно говорить о значительном усилении процессов гибели клеток, в том числе клеток плаценты. Высокие показатели концентрации вкДНК при повышенной активности ДНКазы I свидетельствуют о недостаточно эффективном клиренсе вкДНК из организма. При этом данные УЗИ могут зафиксировать ВЗРП гораздо позднее, поскольку требуется некоторое время для накопления признаков ВЗРП, тестируемых ультразвуком.

ВЫВОДЫ

Исследованы совместные изменения концентрации вкДНК и активности одного из компонентов системы элиминации вкДНК из кровотока — фермента ДНКазы I в плазме крови небеременных женщин, женщин с нормальной беременностью и беременностью, осложненной ВЗРП. Показано, что концентрация вкДНК в плазме матери не является надежным маркером ВЗРП в последнем триместре беременности. Однако одновременное определение концентрации вкДНК и активности ДНКазы I может дать ценную информацию о развитии ВЗРП.