В настоящее время метод флуоресцентного анализа широко используется в биологических и медицинских прикладных исследованиях. С его помощью изучают структуру белков [1–3], диагностируют раковые [4–8] и аутоиммунные заболевания [9], детектируют и классифицируют биологические патогены и токсины [10]. В большинстве подходов для реализации флуоресцентного метода используют специальные флуоресцентные метки. В настоящее время среди подобных меток наиболее перспективны полупроводниковые квантовые точки [8, 11–13]. По сравнению с традиционными органическими красителями квантовые точки обладают широким спектром поглощения [14, 15], высоким квантовым выходом [16] и рекордной фотостабильностью [17]. Кроме того, положение спектра испускания флюоресценции квантовых точек контролируется их размером, поэтому существует возможность «настройки» спектра люминесценции квантовых точек за счет варьированиях размера нанокристаллов [16, 18].

В ряде приложений, например при выявлении низких концентраций различных патогенов, поиске признаков аутоиммунных и онкологических заболеваний, необходимо регистрировать сверхнизкие по интенсивности люминесцентные сигналы [10]. Как известно, лучшие современные фотодетекторы, рассчитанные на работу в видимом спектральном диапазоне, способны регистрировать единичные фотоны [10]. Однако подобная техника требует глубокого охлаждения [19, 20] и крайне чувствительна к внешней фоновой засветке [20]. В совокупности с высокой стоимостью перечисленные факторы ограничивают область применения подобных фотодетекторов уникальными лабораторными установками и коммерческими приборами высокого уровня [21–25]. При этом в области прикладных исследований, связанных с проведением большого количества однотипных измерений, существует потребность в относительно высокочувствительном, компактном, недорогом и устойчивом к внешней фоновой засветке фотодетекторе для люминесцентного анализа.

Наиболее перспективным представляется построение подобного фотодетектора с использованием стандартного кремниевого pin-фотодиода. Для подавления влияния воздействия фоновой засветки, могут быть использованы импульсный [26, 27] и модуляционный [28–30] методы возбуждения люминофора. В рамках первого подхода люминесцентный сигнал регистрируется в течение небольшого промежутка времени, сравнимого с временем жизни возбужденного состояния люминофора после возбуждающего импульса. При грамотном подборе интенсивности возбуждающего импульса пиковое значение амплитуды люминесцентного сигнала будет значительно превышать составляющую сигнала, связанную с фоновой засветкой. Недостатком такого метода является использование широкополосных фотодетекторов и регистрирующей аппаратуры, а также дорогостоящих источников возбуждающего лазерного излучения с длительностью импульса, в зависимости от конкретного флуорофора, в диапазоне от 10 нс до десятков пикосекунд.

При использовании второго подхода, влияние фоновой засветки нивелируется за счет превышения частоты модуляции возбуждающего излучения над характерной частотой флуктуации фонового излучения. Обычно частота модуляции излучения лежит в диапазоне 10–100 кГц [31, 32]. В результате при обработке сигнала появляется возможность выделить фурье-компоненту на частоте модуляции возбуждающего излучения и отсечь сигнал, связанный с низкочастотными колебаниями фона.

Практическая реализация фотодетектора для модуляционного режима возбуждения может быть основана на различных подходах, таких как применение узкополосного усилителя, синхронное детектирование, программный фурье-анализ люминесцентного сигнала или их комбинации [31, 32]. Каждый подход имеет свои особенности. Так, программный фурье-анализ люминесцентного сигнала при использовании усилителя с широкой полосой требует большого динамического диапазона и разрядности аналого- цифрового преобразователя (АЦП), но позволяет получить максимальное количество информации о регистрируемом сигнале. Подход с использованием узкополосного усилителя снижает требования к АЦП приемного устройства, но усложняет конструкцию усилителя.
В целом, модуляционный метод возбуждения люминофора требует более простого источника лазерного излучения, чем импульсный. Метод не лишен недостатков, наиболее очевидным из которых является необходимость длительного накопления сигнала, в то время как метод импульсного возбуждения этого не требует.
Таким образом, на практике оптимальный выбор метода регистрации люминесцентного сигнала низкой интенсивности зависит как от фотофизических свойств используемого люминофора, так и от уровня фоновой засветки. При разработке устройств люминесцентного анализа необходимо также учитывать такие параметры, как быстродействие системы, уровень потребления электроэнергии и стоимость комплектующих.

Целью настоящей работы было проведение комплексного сравнительного анализа методов импульсного и модуляционного возбуждения для регистрации люминесценции низкой интенсивности в видимой области спектра с использованием фотодетекторов на базе кремниевых pin-фотодиодов. В качестве исходного параметра фиксировалась средняя мощность источника возбуждающего излучения. Полученные данные позволят сделать оптимальный выбор системы люминесцентного анализа исходя из времени жизни возбужденного состояния люминофора и уровня фоновой засветки. Обсуждаются вопросы выбора оптимальной частоты модуляции возбуждающего излучения.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для теоретического анализа различных режимов возбуждения флуорофоров в данном разделе будут получены выражения для отношения сигнал/шум на основе стандартной шумовой модели и приведены к удобному для их сравнения виду. В качестве условия сравнения зафиксирована средняя мощность возбуждающего излучения, что позволило сравнить импульсный и модуляционный режимы работы.
Известно, что выходным сигналом подавляющего числа фотодетекторов на основе Si pin-фотодиодов является напряжение [33–36], в то время как сам фотодиод служит источником тока [37]. Для преобразования токового сигнала в напряжение в конструкцию фотодетектора входит трансимпедансный усилитель [38], параметры которого подбирают под конкретную задачу.
Основными характеристиками трансимпедансного усилителя являются сопротивление трансимпеданса Rт и верхняя частота полосы усиления ⨍p. Для сигнала с частотой ниже ⨍p справедливо выражение:

U_s = P_s • S • R_{T ,}

где U_s напряжение на выходе усилителя, P_s — мощность флуоресцентного сигнала, S — чувствительность фотодиода. Шум усилителя характеризуется плотностью шума выходного напряжения u_na. Однако на практике для характеризации шума фотодетектора из соображений удобства предпочитают использовать параметр NEP — эквивалентную шумовую мощность оптического сигнала [37]:

форм. 1

Очевидно, что как NEP, так и порог обнаружения фотодетектора напрямую зависят от шумовых характеристик усилителя и режима работы фотодетектора.
Следует отметить, что шум многокаскадных усилителей определяется шумом их первого каскада [39], в то время как последующие каскады пропорционально увеличивают амплитуду и сигнала, и шума, не меняя их взаимного отношения. Данное обстоятельство дает нам основание в качестве модели для анализа шумовых характеристик использовать однокаскадный усилитель. Как известно, основным источником шума в трансимпедансных усилителях является тепловой шум нагрузочного сопротивления Rf, который соответствует сопротивлению трансимпеданса Rт. Используя стандартное выражение для теплового шума [40] можно записать:

форм. 2

в котором k — постоянная Больцмана, Т — температура сопротивления.
Из выражения (2) следует, что увеличение нагрузочного сопротивления улучшает шумовые характеристики фотодетектора, однако вследствие наличия у фотодиода фоновой емкости C_p [37] одновременно приводит к снижению верхней рабочей частоты ⨍_p. Приняв во внимание связь между R_т и C_p, выражение для NEP можно переписать в виде:

форм. 3

Из выражения (3) следует, что наиболее простой подход для регистрации ультранизкого флуоресцентного сигнала заключается в использовании непрерывного возбуждения исследуемой пробы и фотодетектора с усилителем постоянного тока. Однако такой подход практически никогда не реализуется из-за наличия дополнительных источников шумового напряжения ΔNEP(⨍) в области низких частот, включая фликкер-шум [29, 40, 41], попкорн- шум [40] и флуктуации мощности внешнего освещения [42–45]. На частотах ниже ~1 кГц вклад от данных источников шума может значительно превышать плотность теплового шума и сводить на нет все преимущества низкочастотного фотодетектора [29, 46]. В результате на практике используют методы импульсного и модуляционного возбуждения, которые при грамотном выборе параметров фотодетектора позволяют в значительной степени исключить влияние дополнительных шумов [29]. Вместе с тем каждый из подходов имеет свои особенности.
В случае модуляционного возбуждения при использовании широкополосного усилителя в отсутствии фоновой засветки для отношения сигнал/шум можно записать следующее выражение:

форм. 4

где <P_lum> — средняя мощность флуоресцентного сигнала, P_n — мощность шума, ⨍_m — частота модуляции возбуждающего излучения. Предполагается, что скважность возбуждающих импульсов равна 2, а верхняя граничная частота усилителя ⨍_p равняется частоте модуляции или незначительно превосходит ее.
Вместе с тем фотодетектор, работающий в режиме модуляционного возбуждения, может иметь лишь узкую полосу усиления Δ⨍_p вблизи частоты модуляции ⨍_p. Для реализации такого подхода можно использовать аппаратное или программное синхронное детектирование [32], узкополосный усилитель [47], узкополосный фильтр [47] или усреднение сигнала по множеству измерений [47]. В результате дополнительный вклад в шумы фотодетектора ΔNEP(⨍) может быть практически исключен. В случае ⨍_m = n • Δ⨍_p, где n можно интерпретировать как число периодов, по которому происходит усреднение сигнала, для фотодетектора с узкополосным усилителем можно получить выражение:

форм. 5

Отдельной важной задачей при таком подходе является выбор оптимальной частоты модуляции возбуждающего излучения. Из выражения (5) видно, что следует использовать как можно более низкую частоту, которая будет ограничена лишь требованиями по быстродействию системы. Однако в области частот ниже ~1 кГц возрастает вклад дополнительных шумов и работа в таких режимах нецелесообразна. Наличие внешней засветки требует дополнительного анализа с учетом спектральной плотности флуктуации уровня освещения на разных частотах.

В импульсном режиме возбуждения реализуется идея высокой пиковой интенсивности полезного сигнала

P_lum = <P_lum> • d,

где d — скважность возбуждающих импульсов. Частота следования импульсов ⨍_ex определяется из требований по быстродействию всей системы и ограничена сверху временем жизни возбужденного состояния флуорофора τ_lum. Если при проведении измерений необходимо одновременно получить информацию о τ_lum, то длительность возбуждающего импульса τex должна быть значительно меньше, чем τ_lum. Однако в общем случае она может быть сравнима с τ_lum, что снижает требования к верхней граничной частоте фотодетектора, которая в этом случае равна

⨍_p ≈ 1/τ_lum или ⨍_p = d • ⨍_ex.

Время жизни возбужденного состояния таких флуорофоров, как органические красители и квантовые точки, обычно лежит в диапазоне от 1 до 100 нс [48, 49]. Таким образом, верхняя граничная частота фотодетектора должна быть на уровне ~0,01–1 ГГц. В таких условиях вклад добавочного шума на низких частотах ΔNEP(⨍) пренебрежимо мал по сравнению с полным тепловым шумом в широкой частотной полосе усилителя. В результате для NEP и отношения сигнал/шум фотодетектора, работающего в импульсном режиме возбуждения, можно написать выражения:

форм. 6

Для учета влияния на уровень шумов внешней засветки со средней мощностью P_bg полученные выражения должны быть изменены. Действительно для модуляционного режима возбуждения влияние фоновой засветки проявляется опосредованно в виде увеличения дробового шума. Для импульсного режима влияние внешней засветки проявляется напрямую как флуктуация уровня освещения с некоторой характерной граничной частотой ⨍_bg. С учетом этого, выражения для отношения сигнал/шум для модуляционного и импульсного методов возбуждения флуорофора должны быть представлены следующим образом:

форм. 7

форм. 8

Выражения (7) и (8) дают возможность провести корректное сравнение величин отношения сигнал/шум для модуляционного и импульсного методов возбуждения флуорофора при идентичных быстродействии и средней мощности сигнала флуоресценции, а значит и для одинаковой средней мощности возбуждающего излучения.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

На основе выражений (7) и (8) было проанализировано отношение сигнал/шум в зависимости от различных параметров: мощности и частоты флуктуации внешней засветки фотодетектора, его быстродействия и времени жизни возбужденного состояния флуорофора. Для удобства анализа были построены следующие графики. На рис. 1А и рис. 1Б представлены кривые зависимости отношения сигнал/шум от мощности внешней фоновой засветки для люминофоров с различным временем жизни возбужденного состояния. На рис. 2А и рис. 2Б представлены графики зависимости отношения сигнал/шум от мощности внешней фоновой засветки для различных характерных частот флуктуации мощности внешней фновой засветки.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В отсутствии внешней фоновой засветки фотодетектора метод импульсного возбуждения предпочтителен (рис. 1А и рис. 1Б). При наличии внешней засветки этот метод сохраняет свое преимущество в тех случаях, когда требуется высокое быстродействие системы регистрации флуоресцентного сигнала, а сам флуорофор обладает временем жизни возбужденного состояния не более 1 нс.
В то же время увеличение мощности внешней фоновой засветки уменьшает отношение сигнал/шум в случае импульсного метода быстрее, чем в случае модуляционного. Также необходимо учитывать, что отношение сигнал/шум зависит как от времени жизни возбужденного состояния флуорофора, так и от характерных частот флуктуации мощности фоновой засветки. Таким образом, величина отношения сигнал/шум в случае импульсного возбуждения меньше, чем отношение сигнал/шум в случае модуляции, если время жизни возбужденного состояния люминофора превышает 100 нс. Схожая ситуация наблюдается, если средняя мощность фона превышает ~ 1 мкВт, а характерная частота ее флуктуации превышает 100 Гц. Такие условия возникают в случае применения сканирующих систем или при использовании искусственного освещения [42, 43, 50], особенно светодиодных ламп [46]. Предел обнаружения детектирующей системы при использовании модуляционного метода с правильно подобранной частотой модуляции не будет зависеть ни от времени жизни возбужденного состояния люминофора, ни от характерной частоты флуктуации мощности фоновой засветки (рис. 2А и рис. 2Б).

Время жизни возбужденного состояния квантовых точек лежит, как правило, в диапазоне от 10 до 100 нс. Таким образом, использование модуляционного режима возбуждения для задач обнаружения сверхмалого количества полупроводниковых квантовых точек при наличии фонового освещения со средней мощностью свыше 1 мкВт и временем накопления сигнала не менее 100 мс целесообразнее по сравнению с импульсным режимом. Более того, источники возбуждения для модуляционного режима доступнее по стоимости и проще по сравнению с импульсными источниками с нано- и пикосекундными значениями длительности импульсов.

ВЫВОДЫ

Получено выражение для вычисления величины отношения сигнал/шум для фотоприемников на основе кремниевых pin-фотодиодов, работающих с системами как импульсного, так и модуляционного возбуждения люминесцентных меток видимого диапазона в условиях наличия фонового освещения. Продемонстрировано, что модуляционный возбуждения целесообразнее импульсного применительно к люминесцентным меткам на основе полупроводниковых точек CdSe/ZnS в присутствии фонового освещения со средней мощностью свыше 1 мкВт и временем накопления сигнала не короче 100 мс.