Лучевая терапия, наряду с хирургическими методами и химиотерапией, занимает одно из главных мест в лечении злокачественных опухолей. В настоящее время повышенное внимание уделяется вопросам индивидуальной радиочувствительности пациентов и выбору тактики лучевой терапии [1–3]. Одним из возможных путей повышения эффективности и в то же время снижения побочных эффектов лучевой терапии является использование излучения высокой мощности. Однако в литературе имеются данные как об отсутствии биологических эффектов, так и о более глубоком повреждающем воздействии при увеличении мощности дозы [4–7]. Ранее, в исследованиях in vitro, мы показали, что воздействие фотонного излучения с мощностью дозы ~10⁹ Гр/с на лимфоциты периферической крови человека [8] имеет ряд отличий, по сравнению с излучением с мощностью дозы, применяемой в традиционной лучевой терапии. Полученные различия позволяют высказаться о возможных преимуществах высокомощностного фотонного излучения с точки зрения как терапевтического диапазона, так и более благоприятных для организма механизмов радиационного повреждения. Использование методики облучения фотонным излучением сверхвысокой мощности, возможно, позволит внести новые элементы в лечение онкологических заболеваний.
Целью исследования было определить особенности воздействия фотонного излучения экспериментальной установки МИР-М сверхвысокой мощности на клетки опухолевых линий человека in vitro.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Источником фотонного пучка ультравысокой мощности служила экспериментальная установка «МИР-М», созданная на базе ФГБУ Объединенный институт высоких температур РАН (Москва). Мощность дозы высокоинтенсивного излучения установки «МИР-М» лежала в интервале 1–4 × 10⁹ Гр/мин. В качестве источника излучения с мощностью дозы, традиционно назначаемой для лучевой терапии злокачественных опухолей, использовали гамма- терапевтический аппарат «Рокус-АМ» с источником излучения кобальт-60 (Со-60). Мощность дозы облучения на аппарате «Рокус-АМ» составляла около 1 Гр/мин.

В качестве биологических моделей для исследования эффектов облучения in vitro использовали культуры клеток линий MelMtp-x (меланома человека; коллекция ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н. Н. Блохина»; Россия) и клетки линии A549 (аденокарцинома легкого человека; коллекция Cell Lines Service (Human Lung Carcinoma 300114); Германия). Для обоих типов облучения исследовали цитотоксические эффекты (общее количество погибших клеток, уровни апоптоза и некроза) и влияние облучения на уровень двунитевых разрывов (ДНР) ДНК.
Разморозку и культивирование клеточных культур проводили стандартными методами с использованием сред DMEM для А549 (ПанЭко; Россия) и RPMI 1640 (Gibco; США) для MelMtp-x, содержащих 10%-ю эмбриональную телячью сыворотку (BioWest № S1800; Франция).
Облучение образцов на установке «МИР-М» и терапевтической гамма-установке «Рокус-АМ» производили по описанным ранее методикам [8]. Цитофлуорометрический анализ проводили на проточном цитофлуориметре (Beckman Coulter; США).
Количество ДНР ДНК оценивали по уровню фосфорилирированного гистона Н2А.Х согласно методике производителя с помощью набора 17-344 H2A.X Phosphorylation Assay Kit (for Flow Cytometry) (Millipore; США).
Исследование путей гибели клеток в образцах, подвергшихся облучению, проводили через 24 и 48 ч после воздействия с использованием набора Annexin V-FITC Kit (Beckman Coulter; США), содержащего аннексин V и йодид пропидия, позволяющего одновременно провести оценку уровня апоптоза и некроза [8]. Оценку статистичеcкой достоверности различий проводили на основании критерия Стьюдента. Достоверными считались различия при р < 0,1.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Анализ изменений количества ДНР ДНК в культуре А549 (аденокарцинома легкого) (рис. 1А) показал, что для двух типов излучения достоверных различий нет. В то же время для культуры MelMtp-x обнаружено, что если зависимость «доза–эффект» при воздействии гамма-терапевтической установки «Рокус-АМ» имеет линейный вид, зависимость уровня ДНР при воздействии «МИР-М» носит нелинейный характер (рис. 1Б). При воздействии фотонного излучения сверхвысокой мощности в культуре MelMtp-x наблюдали резкое увеличение количества ДНР в диапазоне доз 2–5 Гр (65,7–80%) (р < 0,1). При дозах более 7 Гр уровни ДНР для двух типов излучения достоверно не различались и достигали максимальных значений 95%.

Анализ количества погибших клеток показал некоторые различия, связанные, по-видимому, как с типом воздействия на клетки, так и с особенностями исследуемых культур (рис. 2). При облучении клеток линии А549 с помощью установки «Рокус-АМ» было показано, что 24-часовая инкубация после облучения не приводит к значимому увеличению количества погибших клеток, количество позитивных по красителю PI (йодид пропидия) клеток не превышало 6% (рис. 2А). Однако увеличение времени инкубации после облучения до 48 ч сопровождается достоверным увеличением числа погибших клеток до 32,6% при 8 Гр и 41,2% при 16 Гр. При облучении клеток MelMtp-x на экспериментальной установке «МИР-М» и временем инкубации 24 ч получены достоверные отличия в уровне позитивных по PI клеток, как с контрольными необлученными образцами, так и с образцами, подвергшимися облучению на «Рокус-АМ» (рис. 2Б). Значимое увеличение доли погибших клеток наблюдалось уже при дозах от 1,4 Гр (14,8%) и достигало наибольших значений при дозе 11,7 Гр (31,2%). В то же время увеличение времени инкубации до 48 ч не приводило к значимому увеличению числа мертвых клеток в образцах, облученных на «МИР-М». Отмечено также, что при инкубации 48 ч отсутствуют достоверные различия между количеством погибших клеток при сравнении двух типов излучения.

Для культуры MelMtp-x было показано, что воздействие гамма-терапевтической установки не приводит к увеличению погибших клеток более чем на 7%, время инкубации не влияет на клеточную гибель. Воздействие установки «МИР-М» и инкубация 24 ч также не дают значимых эффектов, но увеличение времени инкубации до 48 ч приводит к резкому возрастанию доли мертвых клеток в образцах: при дозе 2,5 Гр количество мертвых клеток составляет 13,4%, при дозе 11,8 Гр — 33,8%.

Исследование типов клеточной гибели показало, что больший вклад вносит механизм гибели клеток по пути апоптоза (рис. 3). Для клеточной линии А549 значимые отличия в уровне апоптоза, индуцированного высокомощным излучением, по сравнению с гамма- терапевтическим, наблюдались в дозах от 1,4 Гр при инкубации клеток 24 ч (рис. 3А). При увеличении времени инкубации до 48 ч различия между двумя типами воздействия нивелировались. Однако увеличение уровня апоптоза как для «Рокус-АМ», так и для «МИР-М», было достоверно: при воздействии на клетки фотонным излучением сверхвысокой мощности в дозе 11,7 Гр уровень апоптоза в культуре А549 составил после 24-часовой инкубации 21,4 ± 3,2% и 43,0 ± 5,2% после 48-часовой инкубации. После облучения установкой «Рокус-АМ» в дозе 16 Гр и времени инкубации 24 ч уровень апоптоза в культуре составлял 4,8 ± 0,7; при увеличении времени инкубации до 48 ч он возрастал до 38,4 ± 4,6%.

Для клеточной линии MelMtp-x апоптоз, индуцированный воздействием гамма-терапевтической установки «Рокус-АМ», не превышал 4%, увеличение времени инкубации не влияло на его уровень. Воздействие на клетки MelMtp-x установкой «МИР-М» в дозах от 5 Гр после 48-часовой инкубации приводило к достоверному росту уровня апоптоза (рис. 3Б).

Значимые изменения в уровне некроза, индуцированного воздействием «МИР-М», для А549 наблюдались в дозах 4,3 и 11,7 Гр при 24-часовой инкубации (рис. 4А). Количество некротических частиц от общего числа погибших клеток составило 38,6% для дозы 4,3 Гр и 30,6% для дозы 11,7 Гр и снижалось до 7,1% и 6,1% соответственно при увеличении времени инкубации до 48 ч. Можно предположить, что в культуре А549 некротические клетки эллиминируются в течение двух суток, а процессы апоптоза, индуцированного воздействием высокоинтенсивного рентгеновского излучения, продолжаются.

При исследовании изменения уровня некроза в культуре MelMtp-x было показано, что при времени инкубации 24 ч для обоих типов облучения уровень некроза значимо не повышается (рис. 4Б). При увеличении инкубации до 48 ч уровень некроза возрастал в образцах, подвергшихся облучению на установке «МИР-М» в дозах от 1,58 Гр. Так, при дозе облучения 2,6 Гр он определялся как 8,9 ± 1,07% и составлял 66,4% от общей клеточной гибели; при дозе 11,8 Гр возрастал до 17,5 ± 2,1% (51,8% от общей клеточной гибели).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В проведенных исследованиях было показано, что для двух клеточных линий злокачественных опухолей человека — А549 (аденокарцинома легкого) и MelMtp-x (меланома) — уровень клеточной гибели выше при воздействии фотонного излучения экспериментальной установки «МИР-М», хотя количество индуцированных ДНР ДНК сопоставимо. Для линии А549 определен значимо более высокий уровень апоптоза при воздействии «МИР-М».
Уровень радиоиндуцированных ДНР характеризует повреждающую способность излучения и во многом определяет дальнейшую судьбу клетки [9]. Ответом клетки является активация процессов репарации ДНК, а также запуск программы апоптоза при невозможности восстановления целостности ДНК. Нарушение на любом из этапов репарации ДНР ДНК приводит к образованию хромосомных аберраций, а в дальнейшем гибели клеток [10].

Количество ДНР, регистрируемое в условиях описанного эксперимента, в первую очередь, определяется параметрами излучения и состоянием систем репарации клеток. Полученные нами зависимости уровня ДНР ДНК от типа облучения для культуры А549 практически идентичны и имеют линейный вид, что может свидетельствовать как о сопоставимой силе повреждающего действия излучения установки МИР-М и гамма-излучения терапевтической установки «Рокус-АМ», так и о сохранности систем репарации ДНР в клетках этой линии. Исследование гибели клеток в культуре А549 в зависимости от типа облучения показало, что излучение ≥ 1.4 Гр индуцирует запуск процессов апоптоза через 24 ч после воздействия, в то время как терапевтическое гамма-излучение только через 48 ч. Можно предположить, что повреждения, вызываемые «Рокус-АМ», позволяют клеткам реализовать механизмы репарации, в то время как повреждения клеток линии А549 после воздействия «МИР-М» приводят к более раннему выявлению механизмами репарации клетки необратимости повреждений и активации апоптоза уже через 24 ч после облучения. Высокий уровень апоптоза сохраняется и через 48 ч после облучения, в то время как уровень некроза, индуцированного «МИР-М», резко снижается.

Для клеток культуры меланомы MelMtp-x в дозах от 2,15 до 7,6 Гр отмечался достоверно более высокий уровень ДНР при облучении на «МИР-М». Можно предположить, что уже при дозах ~ 2 Гр количество и характер повреждений ДНК в клетке не позволяют системам репарации реализовать свою функцию. Результаты анализа гибели клеток в культуре MelMtp-x согласуются с данными о радиорезистентности меланом [11, 12]; воздействие терапевтической установки практически не индуцирует клеточную гибель, что может свидетельствовать как об отсутствии активации апоптоза на наличие ДНР [13], так и о высоком уровне репарации ДНР [14]. Однако при облучении на «МИР-М» наблюдалась гибель клеток меланомы, причем в тех же дозах (от 2,15 Гр), в которых наблюдалось повышение уровня ДНР. Гибель клеток индуцировалась на вторые сутки после облучения и проходила по пути как апоптоза, так и некроза примерно в одинаковом соотношении. Возможно, воздействие, оказываемое рентгеновским излучением сверхвысокой мощности на клетки меланомы, вызывает необратимые изменения, которые в ряде случаев являются триггером как для запуска апоптоза, так и для индукции гибели клеток по другим механизмам. Таким образом, было показано, что для двух исследованных клеточных линий злокачественных опухолей человека — А549 (аденокарцинома легкого) и MelMtp-x (меланома) — уровень клеточной гибели выше при воздействии фотонного излучения экспериментальной установки «МИР-М», хотя количество индуцированных ДНР ДНК сопоставимо при использовании максимальных доз. Для линии А549 определен значимо более высокий уровень апоптоза при воздействии излучения «МИР-М».

Перспективность использования излучения сверхвысокой мощности обосновывается в ряде исследований, показаны возможность эффективного воздействия на радиорезистентные опухолевые клетки и минимизация повреждающего воздействия на окружающие ткани при радиотерапии солидных опухолей [15, 16].
Результаты по исследованию клеточной гибели при воздействии на радиорезистентные клетки культуры меланомы излучения установки «МИР-М» представляют как практический интерес с точки зрения возможности клинического использования рентгеновского излучения с параметрами мощности дозы, принципиально отличающимися от применяемых в настоящее время, так и интерес с точки зрения изучения особенностей механизмов радиорезистентности и возможности преодоления этих механизмов для лечения радиорезистентных опухолей.

ВЫВОДЫ

Полученные результаты создают предпосылки для продолжения углубленного изучения влияния фотонного излучения сверхвысокой мощности на биологические объекты. Использование данного типа излучения в терапевтических целях, возможно, позволит повысить эффективность лучевой терапии радиорезистентных опухолей и снизить побочные реакции нормальных тканей.