Современная медицина требует новых подходов к развитию и применению лекарственных препаратов, особенно высокотоксичных антиопухолевых лекарств, так как важна их целевая доставка к биологической мишени. В связи с этим все большее внимание уделяют использованию моноклональных антител [1], биологических транспортеров [2], различных наноструктур и наноплатформ. Среди наноносителей следует выделить фуллерены [3], наноалмазы [4], неорганические наночастицы различной природы [5, 6], липосомы [7], пористый кремний [8], гидроксиапатиты (HAP) [9]. Разработка таких способов транспортировки лекарств преследует несколько целей:

1) снижение токсичности препарата, которая достаточно высока при прямом введении в организм. Хорошим примером понижения токсичности служит доксил — доксорубицин в липосомальном контейнере [10];
2) повышение воздействия на опухоль за счет синергического воздействия препарата и его транспортера [11]. Например, наночастицы на основе порфиринфуллерена (бакминстерфуллерен(C₆₀)-2-(бутадиен-1-ил)-тетра(о-γ-аминобутирил-о-фталил)порфирин, или BFNP) были получены и использованы в качестве носителей магнитных изотопов ²⁵Mg и ⁶⁷Zn, которые сами являются активными препаратами. Такая конструкция способна снижать индуцированный гипоксией ацидоз после химиотерапии [12];
3) повышение биодоступности препарата (например, за счет связывания с альбумином), пролонгированности действия (нанофуллерены, HAP) и усиления воздействия на опухоль за счет целевого попадания в биомишень (моноклональные антитела);
4) создание конструкции, в которой и носитель, и препарат являются антиопухолевыми агентами различного действия. Например, дериватизированные фуллерены, обладающие собственным антиопухолевым действием, несут на себе магнитные изотопы или радионуклиды [13]. Этот случай реализуется при создании радиофармпрепаратов для лучевой терапии — неотъемлемой части антиопухолевой терапии.

Наночастицы HAP представляют интерес в качестве транспортеров как лекарств, так и радионуклидов, благодаря биодеградируемости, биосовместимости и оседанию (встраиванию) в костную ткань. Эти качества обусловлены их кальцийфосфатным происхождением, сходным с химическим составом минеральной части кости человека [14, 15].
Целью работы было исследование свойств НАР разного способа получения (и, соответственно, обладающих различными свойствами) и BFNP как потенциальных носителей ионов биологически активных металлов (в том числе радионуклидов) и лигандов, проявляющих антиопухолевую активность.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Соединения

Хелатор N(5,6-дигидро-4Н-1,3-тиазин-2-ил)бензамид (L¹) в форме гидробромида (L¹HBr) синтезировали по методике, описанной ранее [16]. Для получения комплекса с цинком L¹ZnCl₂ (C¹) лиганд L¹HBr в водном растворе переводили в форму основания (рис. 1). К основанию L¹ в диэтиловом эфире постепенно добавляли раствор хлорида цинка в диэтиловом эфире (в отношении 1 : 1) и перемешивали 0,5 ч. После выпадения белого осадка его выделяли в виде белого кристаллического вещества (выход 64%). Комплекс идентифицировали методами 1Н-ЯМР на спектрометре Bruker CXP-200 (Bruker; Германия) и элементным анализом. L² — 2-аминопиримидин (Sigma; США), L³ — 2-аминопиримидинсалицилат. Их комплексы с цинком Zn(L²)₂Cl₂ (C²) и Zn(L³)₂ (C³) получали, как описано ранее [17].

Спектрофотометрия

Измерения проводили на спектрофотометре UV-1280 (Shimadzu; Япония). Калибровку по лиганду и по комплексу делали в водном, физиологическом и спиртовом растворах.

Константы протонирования и устойчивости

Константы определяли потенциометрически с помощью автотитратора Metrohm 848 Titrino plus (Metrohm AG; Швейцария). При определении константы устойчивости комплекса титрование проводили на автотитраторе со стеклянным индикаторным электродом. При расчете использовали программу Hyperquad 2013.

Синтез HAP

Метод соосаждения. Описаны способы синтеза HAP [18–20], различающиеся параметрами конечного продукта. HAP₁ синтезировали при комнатной температуре и при мольном соотношении Са/Р, равном 1,67, которое соответствует стехиометрии HAP [21]. Количества всех реагентов подбирали таким образом, чтобы в итоге образовалась 5%-я (по массе твердой фазы) суспензия продукта [22]. Остаточное содержание кальция и цинка в маточном растворе анализировали с помощью метода ICP-AES (атомно-эмиссионная спектроскопия с индуктивно связанной плазмой) на приборе Optima 2100 DV (Perkin Elmer; США). Для получения образца HAP₂ по окончании синтеза суспензию нагревали до температуры 90 °С без кипячения и выдерживали в таком режиме 4 ч.

Ферментативный метод. Синтез HAP_E проводили ферментативным гидролизом глицерофосфата кальция в присутствии щелочной фосфатазы (Merk; Германия). При этом варьировали концентрацию фермента, состав среды (водная, глициновый буфер, трис-буфер), pH (7–10), концентрацию кальция и время реакции. Реакцию гидролиза глицерофосфата запускали добавлением раствора фермента к раствору глицерофосфата кальция, взятого в концентрации 0,02 моль/л. Рабочие концентрации фермента находились в интервале 0,02– 0,4 мкг/мл. В зависимости от условий, реакцию проводили от нескольких часов до нескольких суток.

Введение ионов цинка и меди при синтезе HAP. При введении ионов металлов растворяли в H₃PO₄ навеску оксида цинка или меди (химически чистого, х. ч.), соответствующую расчетному мольному отношению Zn(Сu)/Ca, равному 5 (15 мол.%). Полученный раствор вносили по каплям в суспензию Са(ОН)₂ при постоянном перемешивании. Продолжали синтез и получали образцы HAP_Zn1, HAP_Zn2, HAP_Cu. Небольшую часть высушенных препаратов отжигали в муфельной печи на воздухе при температуре 900 °С в течение 3 ч и исследовали методом RPA (см. ниже).

Электронно-микроскопическое исследование образцов HAP

Небольшую часть образца обрабатывали ультразвуком в ультразвуковой ванне 30 с (при частоте ультразвука 22 кГц, мощности 50 Вт). После стандартной подготовки образца использовали микроскоп JSM-6380LA (JEOL; Япония) при ускоряющем напряжении 20 кВ.

Нуклиды металлов

^69mZn (Т_1/2 = 13,7 ч; Еγ = 438,7 кэВ) получали по реакции ⁷¹Ga(γ, np)^69mZn, как описано ранее [21]. Для получения меченого соединения проводили изотопный обмен в течение 30 мин комплекса С1 в физиологическом растворе и этиловом спирте в соотношении 1 : 1 с предварительно упаренным раствором, содержащим 69mZn без носителя, полученным с хроматографической колонки. Для получения меченых комплексов С² и С³ лиганды в форме оснований обрабатывали раствором ^69mZnCl₂ при перемешивании и нагревании.

^64,67Cu (Т_1/2 = 12,7 ч и 61,8 ч соответственно; Е_γ(⁶⁴Сu) = 1345,8 кэВ, Е_γ(⁶⁷Cu) = 184,5 кэВ) получали по реакции ^natZn(_γ,np)⁶⁴Cu; ^natZn(n,β)⁶⁷Cu. Медь отделяли от цинка экстракцией раствором 0,001% дитизона в CCl₄, реэкстракцией в 6М HCl и ионно-обменной хроматографией на колонке c сорбентом Cu-Resin (Triskem; Франция). Измерение радиоактивности продуктов проводили на гамма-спектрометре с полупроводниковым детектором GC 3020 (Canberra; США). ⁶⁷Zn и ²⁵Mg — стабильные изотопы со значениями s, равными –5/2 и +5/2 соответственно (⁶⁷Zn обогащение 94,5%, изотопная чистота ²⁵Mg 99,9%) («Изотоп»; Россия).

Определение размера наночастиц

Размер наночастиц определяли по методу динамического рассеяния света.

Тонкослойная хроматография (TLC)

Использовали пластины Silufol с разными элюентами. Проявление неактивной хроматограммы осуществляли парами йода.

Авторадиография (ARG)

Пластину после TLC с радиоактивными веществами характеризовали с помощью цифровой ARG, используя запасающие пластины (Storage phosphor system), покрытые BaFBr:Eu (Perkin Elmer; США), и прибор для сканирования Cyclone Plus (Perkin Elmer; США).

Рентгенографический фазовый анализ (RPA)

Дифрактограммы получали на автоматизированном рентгеновском дифрактометре ДРОН-3 («Инноскоп»; Россия) с прилагаемыми программами обработки результатов. Измерения проводили на Cu-K_α. Размеры кристаллитов (блоков) D оценивали по формуле Шеррера:

формула .

Адсорбционные измерения

Адсорбционные измерения проводили на автоматическом сорбтометре ASAP 2000 (Micromeritics; США). Расчет удельной поверхности проводили с помощью пакета программ фирмы Micromeritics, входящего в комплектацию прибора.

МТТ-тест

Подробное описание процедуры представлено ранее [13]. Использовали линии клеток HL-60, K-562, MOLT-4 и MOLT-4 (res) (res — линия клеток, резистентных к аспарагиназе, одному из основных препаратов для лечения острых лейкозов у детей), культивированные стандартным способом. Статистический анализ проводили с помощью критерия Манна–Уитни. Количество экспериментов в каждом случае было не менее пяти (c трехкратным повтором).

Выделение мононуклеарных клеток из костного мозга и периферической крови

Клетки костного мозга (КМ) пациентов с диагностированным острым В-лимфобластным лейкозом (В-ОЛЛ), острым миелоидным лейкозом (ОМЛ) или острым Т-лимфобластным лейкозом (Т-ОЛЛ) были любезно предоставлены в НМИЦ ДГОИ им. Д. Рогачева. Процедура отбора подробно описана [13]. Содержание бластных клеток в мононуклеарной фракции периферической крови составляло не менее 80% по результатам гематологического исследования.
Морфологические исследования производили на флуоресцентном микроскопе LEICA DM6000B (Leica Microsystems; Германия) или на лазерном сканирующем конфокальном микроскопе LSM 710 (Carl Zeiss; Германия). Изображение фиксировали с помощью видеосистемы на основе цифровой камеры.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Влияние размеров наночастиц порфиринфуллеренов на их цитотоксичность

Результаты ряда исследований позволяют предполагать, что усиление агрегации наночастиц (фуллереновых, в частности) увеличивает величину выживаемости (LC₅₀), т. е. уменьшает цитотоксичность препарата [23–26]. Однако имеются и противоположные данные, в основном, для наноС₆₀. Мы рассмотрели влияние этого параметра на примере наночастиц BFNP.
В табл. 1 представлены данные по выживаемости линий лейкемических клеток и клеток КМ нелеченых пациентов с острыми лейкозами под действием ионов цинка (природного изотопного состава и обогащенных магнитным ⁶⁷Zn), связанных с BFNP. Получена зависимость величины LС₅₀ от размера наночастиц. Во всех случаях выживаемость клеток увеличивается с ростом агрегатов, однако направленность действия препаратов не меняется.
Обработка ультразвуком приводила к уменьшению среднего размера наночастиц до 15–20 нм, однако, как показали эксперименты, через неделю средний размер составлял 20–30 нм, через 2 недели — 30–40 нм, через месяц — 50–60 нм.
Морфологические исследования показали, что не только наночастицы, но и клетки, обработанные BFNP с магнитным изотопом цинка, подвержены усиленной агрегации (данные не представлены).

Воздействие на клетки лигандов, потенциально перспективных для нанесения на HAP

Потенциальными хелаторами (антиопухолевыми агентами), предлагаемыми для нанесения на наночастицы HAP, могут быть как лиганды, так и их комплексы с ионами металлов, в частности с ионами цинка и меди (которые в перспективе могут быть заменены или обменены на короткоживущие радионуклиды с получением радиофармпрепаратов). Вещества могут наноситься на HAP как в виде комплекса, так и по отдельности в виде ионов металла и лиганда- хелатора. В обоих случаях комплекс или его компоненты будут действовать либо синергически, либо по отдельности.

В табл. 2 представлены результаты выживаемости клеток линии К-562 под действием лиганда L¹ и комплексов в сравнении с клетками нормальных лимфоцитов здоровых доноров (ЗД). На нормальных лимфоцитах и линиях клеток MOLT-4 и MOLT-4 (res) показана очень высокая выживаемость клеток под действием различных образцов HAP, в том числе содержащих ионы металлов цинка и меди.
Для исследованных хелаторов и комплексов характерны тенденции к увеличению (уменьшению) цитотоксичности по отношению к нормальным лимфоцитам и раковым клеткам. Среди клеток здоровых доноров выживаемость снижается в следующей последовательности: L¹ > C¹ > ZnCl₂ > C³ > ZnSal₂(H₂O)₂ > C². По отношению к линии хронического миелолейкоза К-562 эта последовательность изменяется: С¹ > L¹ > ZnCl₂ > ZnSal₂(H₂O)₂ > C³ > C². Величина терапевтического окна, или терапевтического индекса (ТИ = LC₅₀ (ЗД)/LC₅₀ (лейкемические клетки)), уменьшается в ряду: L¹ > C³ ~ C¹ > ZnCl₂ > C² > ZnSal₂(H2O)₂. Таким образом, все три комплекса представляют интерес в качестве антиопухолевых агентов.
При сравнении воздействия комплекса С² на различные линии клеток и клетки КМ пациентов с В-ОЛЛ получили следующую последовательность: клетки ЗД > K-562 > HL-60 ~ MOLT-4 (res) > MOLT-4 ~ KM (В-ОЛЛ). Важно, что С² более цитотоксичен по отношению к клеткам MOLT- 4 (res), по сравнению с линией обычных клеток MOLT-4. Таким образом, наблюдается специфичность к клеткам, вызывающим наибольшие осложнения при химиотерапии (рис. 2).

Важной характеристикой лигандов и комплексов является их устойчивость, особенно в водном/ физиологическом растворе. К сожалению, чаще встречаются биологически активные лиганды-хелаторы и комплексы, плохо растворимые в воде. Для них требуется обязательный носитель или специальная упаковка при введении в организм. Частично эту функцию может выполнять HAP.
Спектрофотометрические исследования устойчивости комплексов в водных, спиртовых и физиологичесих растворах показали, что наименее устойчив комплекс С¹: через некоторое время он гидролизуется с образованием тиазина (который, однако, также проявляет слабые антиопухолевые и высокие радиопротекторные свойства). Остальные комплексы были достаточно устойчивы в течение времени после разведения, необходимого для применения в медицинских целях.

Метод потенциометрического титрования лиганда L¹, проведенный в водном и физиологическом растворах в зависимости от рН (при С (L¹) = 1 • 10^-3 моль/л, I = 0,15 NaCl (0,1 моль/л KNO₃)), показал, что константы протонирования равны log K = 5,1 ± 0,1 (водный раствор) и logK = 5,3 ± 0,2 (физиологический раствор). Попытка потенциометрически определить константу устойчивости комплекса С¹ не принесла успеха. Это может быть связано с образованием гидроксида цинка, мешающим проведению титрования. Для комплекса С² константа устойчивости составляла logK (С²) =10,4 ± 0,5.

Поведение наноHAP, несущих лиганды, ионы металлов и/или комплексы

На рис. 3 (А, Б) показано поведение (сорбция) лиганда L1 на HAP1 и HAP2. Изменения наблюдаются только в первый момент сорбции, вероятно, за счет взаимодействия с некоторым количеством кальция в суспензии, появляющимся за счет растворения наноHAP. Это значит, что лиганд L¹ не связывается с гидроксиапатитом. Аналогичную картину можно наблюдать и для L² и L³.

Метод электронной микроскопии дает возможность представить морфологию нанокристаллов, а рентгеновские дифрактограммы позволяют оценить состав твердой фазы, соответствующий биогидроксиапатиту. Для HAP1 эти результаты представлены на рис. 4. Средние размеры для цинк-содержащих и «чистых» наночастиц показывают уменьшение размеров в случае термообработки, которое значительно для «чистых» и практически незначимо для цинк-содержащих наночастиц (табл. 3).

Для HAP_E (рис. 5А) показано образование гидроксиапатита в качестве основной фазы (рис. 5Б) и наблюдается сферическая форма наночастиц, образующих микроагрегаты. Удельная поверхность образца, определенная по адсорбции азота, составляла 300 м2/г. При этом наблюдалось широкое распределение пор по размерам (2–300 нм). Размеры кристаллитов в образцах, имеющих кристаллическую структуру, оценивали по формуле Шеррера. Их размер составил 12–14 нм. Наблюдали большую разницу в размерах кристаллитов и агрегатов, средние размеры которых показаны на рис. 6.

В работе использовали шесть различных форм HAP: не содержащие ионы металлов HAP₁, HAP₂, HAP_E, а также HAP_Zn1, HAP_Zn2, HAP_Cu. HAP_E отличался сферической формой (сферы полые), большими размерами и увеличенными сорбционными свойствами. Средние размеры остальных располагаются в следующем ряду: HAP₁ > HAP_Zn1 > HAP_Zn2 ~ HAP_Cu > HAP₂.

Были получены величины удельной адсорбции ионов цинка и меди на HAP₁ и HAP_E, а также изотермы адсорбции по Ленгмюру и Фрейндлиху. Сорбция ионов меди полностью соответствует модели Ленгмюра, а ионов цинка с равными коэффициентами корреляции соответствует моделям и Ленгмюра, и Фрейдлиха.
Сорбционная емкость HAP по отношению к ионам меди оказалась значительно выше, чем к ионам цинка. Введение цинка мало влияет на размеры частиц. Однако средние размеры термически обработанного HAP₂ меньше, чем у HAP₁. Частицы HAP₂ приобретают более правильную изометрическую форму (увеличивается их толщина) по сравнению с HAP₁, что приводит к уменьшению их удельной поверхности. Как результат, максимальная сорбционная емкость для HAP₂ уменьшается.

Комплексы с радионуклидами цинка и меди

С помощью изотопного обмена были получены ^69mZnC¹ (I), ^69mZnC3 (II) и [(L²)264,⁶⁷CuСl₄] (III) и охарактеризованы методами TLC, ARG и γ-спектрометрией. Время изотопного обмена подбирали экспериментально, чтобы величины Rf радиопрепаратов совпадали с таковыми для препаратов без радионуклида и не образовывалось побочных продуктов. После этого полученные соединения сорбировали на HAP и проводили повторно физико- химические измерения. Готовые радиопрепараты имели аналогичные свойства, однако комплекс с медью при «посадке» на HAP₁ разлагался. В этом случае наноHAP сорбировал только ионы меди. Возможно, эту проблему можно будет решить введением комплекса в HAP непосредственно в процессе его синтеза.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Ранее было показано, что магнитный изотоп ²⁵Mg (доля в природной смеси изотопов равна 11%) является гиперактивирующим элементом магний-зависимого контроля синтеза АТФ, что делает направленную доставку этого изотопа к пораженным гипоксией клеткам/ тканям перспективной фармакологической задачей [12]. Наночастицы BFNP, способные к пролонгированному выпуску ионов Mg²⁺ и Zn²⁺, могут служить средством такой доставки. Однако основным сдерживающим фактором для клинического применения любых фуллереновых производных является возможная неконтролируемая агрегация наночастиц с изменением их первоначальных цитотоксических и физиологических свойств. Приведенные в нашей работе данные показывают, что происходящие изменения размеров не ведут к принципиальным изменениям свойств частиц, хотя и уменьшают степень их воздействия на опухолевые клетки. Таким результатом является уменьшение примерно в 6–7 раз выживаемости клеток КМ нелеченых пациентов с диагнозом В-ОЛЛ в присутствии ⁶⁷Zn-BFNP по сравнению с ^natZn-BFNP. Использование предварительной ультразвуковой обработки способно замедлить агрегацию.

Наночастицы HAP имеют богатую перспективу применения для drug delivery, так как могут быть синтезированы различными способами, что дает в результате частицы с разными характеристиками по размерам, форме и их сорбционным свойствам. Кроме того, они обладают очень низкой цитотоксичностью. Введение лигандов и комплексов непосредственно в процесс синтеза, вероятно, является более удачным приемом, сохраняющим свойства всех компонентов соединения. Особенно перспективным выглядит ферментативный способ получения носителя, так как в этом случае возможны вариации условий, приводящие к сильно различающимся параметрам частиц. Это расширяет возможности их применения.

Микроэлементы имеют большое значение для нормального функционирования организма. Среди них важнейшая роль принадлежит цинку и меди [27, 28]. Они являются кофакторами большинства регуляторных и антиоксидантных ферментов, включены в работу репаративной системы и транскрипционных факторов. Поэтому появление комплексов, содержащих короткоживущие радионуклиды этих микроэлементов, позволяет решать задачи по диагностике и терапии по отдельности и совместно. HAP может служить подложкой, обеспечивающей совместное пролонгированное действие конструкции. Как правило, для этого требуется вектор, в качестве которого оптимальны моноклональные антитела. Однако НАР сам может встраиваться в кость и костную ткань, и тогда выступает вектором доставки радиофармпрепарата. Этот процесс может иметь значение при лечении онкологических заболеваний костной ткани и злокачественных нарушениях кроветворения на уровне стволовых раковых клеток.
Удельная активность радиопрепаратов в данной работе была невысокой, поскольку эксперименты имели предварительный характер и должны были показать возможность создания и использования таких комплексов в разумный для применения в медицинских целях период времени. Имеются резервы для создания соединений большей удельной радиоактивности.

ВЫВОДЫ

Изменение размеров ⁶⁷Zn-BFNP вследствие агрегации качественно не влияло на функцию наночастиц, но количественно уменьшало воздействие на лейкемические клетки. Варьирование способов получения и обработки наночастиц НАР позволяет менять их сорбционную способность по отношению к ионам металлов и к лигандам и комплексам. HAP_E может быть получен с заранее заданными свойствами путем варьирования условий синтеза. Получены наночастицы HAP, представляющие собой радиопрепараты, содержащие короткоживущие изотопы цинка и меди (в виде ионов и соединений). Эти наноконструкции представляют интерес для применения при решении задач диагностики и лучевой терапии.