В последнее время активно развивается новый подход к разработке фармацевтических композиций, заключающийся в попытке одновременно решить терапевтические и диагностические задачи [1]. Для этого в качестве диагностических маркеров можно использовать различные флуорофоры [2]. В настоящее время лишь два флуорофора разрешены для клинического применения: индоцианин зеленый и различные комбинации флуоресцеина [3]. При этом флуоресцентные красители имеют существенный недостаток — они выгорают со временем. Материалом, лишенным такого недостатка, являются коллоидные квантовые точки (КТ) [4]. При этом многие КТ обладают токсическими свойствами [5]: кристаллические ядра материалов токсичны при использовании в биомедицине. Нередко в структурах типа «ядро/оболочка» ядром является соединение с тяжелым металлом, а оболочка не полностью покрывает ядро или может быть разрушена, что приводит к высвобождению ионов тяжелых металлов в организм. Было высказано предположение, что токсичность КТ может быть также связана с физико-химическими свойствами оболочек, природой поверхностных «лигандов» (обеспечивающих коллоидную стабильность), наличием других модификаций поверхности и взаимодействием с различными молекулами (например, белками), присутствующими в биологических средах [6–11]. Поэтому важной практической задачей является разработка нетоксичных КТ и изучение их биосовместимости. Результаты исследований, проведенных в последние годы, показывают, что модификация поверхности КТ либо использование КТ определенного состава сопровождаются значительным повышением биосовместимости данных объектов. Так, КТ на основе CdSe/ZnS, конъюгированные с трипептидом аргинин — глицин — аспарагиновая кислота (RGD), при системном введении мышам не показали токсических свойств, подтверждаемых гистологическим исследованием, а анализ образцов тканей при помощи масс-спектрометрии не выявил Cd2⁺ [12]. В другой работе оболочку из биосовместимых сополимеров на основе
2-(2-метоксиэтокси) этилметакрилата и олиго(этиленгликоль)метакрилата выращивали на поверхности квантовых точек ZnO путем поверхностной инициированной радикальной полимеризации [13]. При оценке цитотоксичности по отношению к клеткам HT29 рака толстой кишки человека было показано, что КТ с полимерным покрытием практически не проявляли токсичности при концентрациях до 12,5 мкг/мл, тогда как при загрузке доксорубицином наблюдались высокая цитотоксичность и снижение жизнеспособности раковых клеток HT29. Получены и детально охарактеризованы нанокомпозиты, содержащие КТ селенида серебра со средним размером 11,4–12,7 нм, люминесцирующие в области прозрачности биологических тканей (705 нм) [14].

Отсутствия токсических свойств материалов достигали использованием стабилизирующего потенциала природного полисахарида галактоманнана, а также простым экологичным способом генерирования высокореакционноспособных селенид-анионов, выступающих в качестве селенирующего агента. Нетоксичны также углеродные квантовые точки и их сочетания с различными наночастицами, например, на основе железа [15].
Особый интерес представляют КТ, не содержащие потенциально токсичных элементов в своем составе. К таким КТ относятся, в частности, КТ на основе соединения AgInS₂ в оболочке ZnS.
Целью настоящей работы было изучить физические свойства, биораспределение и биосовместимость КТ на основе AgInS₂/ZnS.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Синтез коллоидных КТ

Химический синтез коллоидных КТ AgInS₂/ZnS осуществляли инжекционным методом в водной среде. Для достижения баланса реакционной способности катионов индия и серебра в синтезе применяли такие лиганды, как L-глутатион и цитрат натрия. Прекурсоры нитрата серебра — AgNO₃ (0,005 ммоль) и нитрата индия —In(NO₃)₃•4,5H₂O (0,02 ммоль) помещали и растворяли в 5 мл дистиллированной воды в колбе объемом 10 мл. Последовательно в данный раствор добавляли 0,01 ммоль L-глутатиона и 0,08 ммоль цитрата натрия (200 мкл водного раствора). Анионный прекурсорный раствор представлял собой 0,04 ммоль Na₂S•9H₂O в 500 мкл дистиллированной воды. В исходный раствор инжектировали прекурсорный раствор серы при комнатной температуре, затем с помощью колбонагревателя производили нагрев до 95 °С в течение 40 мин. Для создания оболочки, состоящей из сульфида цинка, в 200 мкл дистиллированной воды растворяли 0,02 ммоль нитрата цинка (Zn(NO₃)₂•6H₂O) и 0,02 ммоль сульфида натрия (Na₂S•9H₂O). После охлаждения исходного раствора ядер нанокристаллов до комнатной температуры в него вводили одновременно прекурсорный раствор нитрата цинка и сульфида натрия (покапельно), затем нагревали до 95 °С в течение 40 мин. Для выделения частиц из исходного раствора добавляли изопропиловый спирт с последующим центрифугированием.

Оценка физических свойств КТ

Оценку размеров КТ осуществляли методом динамического рассеяния света с помощью лазерного анализатора размера частиц SZ100 (Horiba Jobin Yvon, Kyoto; Япония) с диапазоном измерения диаметров наночастиц 0,3–8 мкм. Оптические спектры (поглощения) образцов измеряли c использованием спектрофотометра PE-5400UV (ECROSKHIM Co., Ltd; Россия), а спектры фотолюминесценции получали с использованием специально разработанного спектрофлуориметра на основе монохроматора МДР-206 (Lomo Fotonika; Россия).

Оценка биораспределения КТ

Флуоресцентный имиджинг образцов органов животных, полученных через 1 и 24 ч после внутривенного введения КТ, проводили на приборе IVIS Lumina LT Series III (Perkin Elmer; США). Для квантовых точек AgInS₂/ZnS после предварительного исследования спектров поглощения и фотолюминесценции подбирали оптимальные фильтры на флуоресцентном имиджере. Длина волны возбуждения данных КТ составила 535 ± 20 нм, эмиссии — 655 ± 20 нм.

Исследование биосовместимости КТ

Оценку биосовместимости проводили на крысах-самцах стока Wistar SPF-категории (питомник лабораторных животных «Пущино»; Россия). Масса тела животных составляла 235 ± 23 г. Исследуемые КТ вводили в течение 3 мин в латеральную хвостовую вену. Формирование групп животных и их краткая характеристика представлены в таблица. Для идентификации квантовых точек и их концентраций вводили следующие обозначения: концентрация КТ 3,7 • 10^-9 моль/кг — L (large), 1,85 • 10^-9 моль/кг — M (medium), 1,85 • 10^-10 моль/кг — S (small). Через 15 и 30 дней после внутривенного введения КТ у животных регистрировали гематологические показатели, динамику массы тела, а также вели учет погибших животных.

Гематологические исследования

Гематологические исследования проводили на гематологическом анализаторе URIT-3000 Vet Plus (URIT Medical Electronic; Китай). Для оценки воздействия КТ на организм обращали внимание на следующие гематологические показатели: эритроциты (RBC), средний объем эритроцитов (MCV), лейкоциты (WBC), гемоглобин (HBG), среднее содержание гемоглобина в эритроцитах (MCHC), средний объем эритроцита (MCH), средний объем тромбоцитов (MPV), гематокрит (HCT), абсолютное содержание тромбоцитов (PLT).

Статистический анализ

Методами дисперсионного анализа для повторных измерений была проведена проверка гипотезы о равенстве средневыборочных величин в нескольких зависимых выборках, значения динамики массы и гематологических показателей в группах — методами непараметрической статистики с указанием медианы, 25-го и 75-го процентилей (Ме (25%–75%)). Проверку гипотезы о равенстве средневыборочных величин в независимых выборках проводили с использованием критерия Манна–Уитни. Статистически значимыми считали различия при уровне значимости р < 0,05. Вычисления производили в программе GraphPad Prism 7.04 (GraphPad Software Inc; США).
Работа выполнена с применением оборудования ресурсных центров «Оптические и лазерные методы исследования вещества» и «Инновационные технологии композитных наноматериалов» Санкт-Петербургского государственного университета.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Характеристика КТ AgInS₂/ZnS

Результаты исследования КТ методом динамического светорассеяния показано на рис. 1. Наибольшая доля КТ имела средний радиус от 3,0 до 4,5 нм.
На рис. 2 представлены спектры экстинкции и фотолюминесценции водной дисперсии квантовых точек AgInS₂/ZnS. Дисперсия КТ показала пик эмиссии при 627 нм.
Спектр фотолюминесценции отличают заметная несимметричность и достаточно большое значение полуширины на полувысоте. Вместе с большим стоксовым сдвигом это свидетельствует о механизме фотолюминесценции за счет дефектов — внутренних и, возможно, поверхностных [16–19]. В этом случае полуширина спектра может зависеть не только от распределения частиц по размерам, но и от распределения и природы дефектов в нанокристаллах [20]. Спектр поглощения не содержит ярко выраженных точек перегиба или максимумов, что в целом характерно для нанокристаллов тройных халькогенидов металлов [16, 21].

Биораспределение КТ

С помощью флуоресцентного визуализатора IVIS Lumina LT Series III была проведена предварительная оценка биораспределения КТ в органах ex vivo через 1 и 24 ч после внутривенного введения КТ в дозе 4 • 10^-6 моль/л (рис. 3).
При исследовании биораспределения КТ на основе AgInS²/ZnS было отмечено накопление наночастиц с течением времени в таких органах, как печень, почки, легкие и сердце. Интенсивность флуоресценции печени через 24 ч после введения КТ была значимо выше, чем через 1 ч после введения, что свидетельствует о накоплении КТ в печени в течение первых суток после введения, тогда как значимых различий уровня флуоресценции в других органах в точках 1 ч и 24 ч отмечено не было.

Масса тела животных

Динамика массы тела у животных всех опытных групп представлена на рис. 4.
Статистический анализ данных показал отсутствие значимых различий массы тела животных подопытных групп в сравнении с контролем в течение всего эксперимента (p > 0,05).

Гематологическое исследование

Основные гематологические параметры, измеренные на 15-й и 30-й день после введения КТ, представлены на рис. 5.
Изменения гематологических показателей подопытных групп не показали достоверной разницы в сравнении с контрольной группой (p > 0,05).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

КТ представляют собой отличную альтернативу традиционным органическим флуорофорам, поскольку их размер, химические характеристики поверхности, спектральные свойства и стабильность могут быть легко настроены для оптимизации визуализации in vivo/in vitro. На данный момент в биомедицине КТ разрабатывают и применяют для различных целей, таких как доставка лекарств, диагностические процедуры, визуализация опухолей [21–30]. Следует отметить, что проблемы биораспределения квантовых точек в настоящее время широко исследуют: по данным ряда авторов, их применение в качестве маркеров клеток для визуализации опухолей разных тканей имеет положительные результаты [31–36]. Основными органами-мишенями, в которых происходит накопление квантовых точек, являются печень, почки и селезенка [37–39], легкие [40], кожа, желудочно-кишечный тракт и мочевой пузырь [41], помимо этого, квантовые точки обнаруживаются в лимфатических узлах [42]. В настоящей работе синтезированные инжекционным методом в водной среде коллоидные КТ были использованы для ex vivo визуализации биологического распределения. Полученные нами данные позволяют предположить, что КТ на основе AgInS₂/ZnS обладают существенной тропностью к печени, о чем свидетельствует повышение интенсивности флуоресценции с 1 до 24 ч после внутривенного введения. КТ в диапазоне доз от 2 • 10^-7 до 4 • 10^-6 моль/л не обладали системной токсичностью, что подтверждается отсутствием существенных изменений в динамике массы тела и достоверных различий по гематологическим показателям, а также отсутствием гибели животных в течение 30 дней после введения. Учитывая тот момент, что в большинстве случаев экспериментальные образцы КТ на основе Cd/Se-ZnS [43] обладают выраженной системной токсичностью, что сказывается, в частности, на гематологических показателях [44], можно предположить, что КТ AgInS₂/ZnS после дополнительного тестирования на животных могут быть применены в качестве флоурофоров в медицинской практике, а возможность иммобилизации на их поверхности лекарственных средств позволит использовать их для тераностики.

ВЫВОДЫ

Коллоидные КТ AgInS₂/ZnS, полученные инжекционным методом в водной среде, при исследовании биолюминесценции, проявили себя как стабильные структуры, которые могут быть использованы в продолжительных исследованиях. Оценка биораспределения КТ показала, что они имеют свойство накапливаться в таких органах, как печень, легкие, сердце и почки. Исследование биологической совместимости КТ показало, что в диапазоне доз от 2 • 10^-7 до 4 • 10^-6 моль/л при внутривенном введении крысам КТ не оказывают значимого влияния на динамику массы тела и основные гематологические показатели на протяжении 30 дней.