Наличие препаратов, способных эффективно и избирательно накапливаться в опухолевых тканях, является определяющим фактором в обеспечении терапевтической эффективности таких методов лечения злокачественных опухолей, как радионуклидная терапия, нейтрон-захватная и фотон- захватная виды терапии [1]. В последнее время большой интерес вызывает разработка препаратов на основе дендримеров [2–6] — шарообразных молекул 2–10 нм, содержащих во внешней сфере большое количество химических функциональных групп, позволяющих присоединять к дендримеру различные молекулы. На их основе можно создавать конструкции с присоединенным к дендримеру опухолеспецифичным агентом для обеспечения туморотропности и диагностическим и/или терапевтическим агентом для обеспечения функциональной пригодности. Ранее нами были показаны возможность и перспективность такого подхода для терапии и диагностики злокачественных опухолей [7–8]. Перспективным может быть подход с использованием рецепторов опухолевых клеток к некоторым низкомолекулярным соединениям. Так, конструкции на основе дендримеров с β-эстрадиолом показали эффективное накопление в трансплантированной аденокарциноме молочной железы Са755 [9]. В настоящей работе адресным компонентом конструкции служит RGD-пептид, который связывается с интегринами на поверхности опухолевых клеток [10–17].
Целью работы было экспериментально in vivo изучить возможности применения конструкций на основе созданных нами дендримеров в лучевой терапии и диагностике.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследованная наноконструкция (НК) представляет собой дендример первой генерации, к которому ковалентно присоединены сафранин для связывания перрената и RGD-пептид для обеспечения туморотропности. Дендример, лежащий в основе изучаемой НК, описан в более ранней работе [7]. На рис. 1 представлена описанная НК; ее строение подтверждено ПМР-спектроскопией.

В качестве терапевтического агента использовали радионуклид ¹⁸⁸Re. Период полураспада ¹⁸⁸Re составляет 17 ч. Данный радионуклид при распаде испускает β-излучение с энергией, равной 2,12 МэВ, обеспечивающее противоопухолевый эффект, и γ-излучение, в том числе с энергий 155 кэВ и выходом 15,2%, позволяющим контролировать распределение РФП в организме больного с помощью γ-камеры [18–23]. Генераторная система ¹⁸⁸W/¹⁸⁸Re позволяла продуцировать радионуклид ¹⁸⁸Re в течение 4–6 месяцев [24], поэтому проводить мечение соединений ¹⁸⁸Re возможно непосредственно перед применением РФП.

Мечение НК при помощи ¹⁸⁸Re осуществляли путем добавления перрената натрия, элюированного из генератора ¹⁸⁸Re ГРЕН-1 (АО ГНЦ РФ ФЭИ; Россия). При приготовлении рабочих растворов соединений количества ¹⁸⁸RE-НК рассчитывали в соответствии с молярностью вносимого ¹⁸⁸Re (1 МБк ¹⁸⁸Re — 0,00015 нМ). Для полного связывания ¹⁸⁸Re брали не менее чем 100-кратный избыток НК; радиоизотоп добавляли в исследуемые соединения еx tempore. ЯМР-спектры снимали на спектрометре WH-360 (Bruker; Германия) с рабочей частотой 360 МГц.

Тонкослойную хроматографию проводили с использованием пластинок с силикагелем типа Si 60 (размер частиц 5–17 мкм) (Fluka; США). Хроматограммы проявляли в парах йода.

Оценку острой токсичности ¹⁸⁸RE-НК проводили только по токсичности исходного немодифицированного дендримера, вследствие высокой стоимости RGD-пептида. Токсикологические испытания дендримера проводили на здоровых самцах мышей линии Ваlb/c весом 19–21 г (питомник ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий», филиал «Столбовая»; Россия). Все исследования на животных были выполнены в соответствии с этическими нормами обращения с животными [25].

Животных содержали при естественном освещении в стандартных условиях конвенционального вивария. Для проведения исследования формировали 10 групп одновозрастных животных по 6 особей в группе. Исследование проводили для 10 доз дендримера. Дендример, растворенный в 0,9%-м растворе NaCl с 10%-м содержанием ДМСО, вводили животным однократно интраперитонеально в объеме 0,2 мл раствора. Дозы дендримера на мышь составляли: 62,5 мг/кг; 125 мг/кг; 187,5 мг/кг; 250 мг/кг; 375 мг/кг; 500 мг/кг; 750 мг/кг; 1000 мг/кг; 1250 мг/кг; 1500 мг/кг. Наблюдение за животными осуществляли в течение 30 дней, ежедневно отмечая изменения в их общем состоянии и поведении. Павших мышей вскрывали, оценивали степень изменения внутренних органов. По окончании эксперимента оставшихся в живых мышей подвергали эвтаназии методом цервикальной дислокации. Критериями оценки острой токсичности соединения служили: число павших животных и сроки их гибели, клиническая картина развивавшегося процесса и изменение поведенческих реакций, а также посмертные патологические изменения в тканях и внутренних органах (макроскопическая оценка) [26–28]. В дальнейшем, с использованием программы BioStat Pro 2008 5.0.1 (AnalystSoft; США), были рассчитаны значения токсических доз.

Биораспределение созданной конструкции ¹⁸⁸RE-НК изучали в сравнении с биораспределением ¹⁸⁸Re-перрената натрия на животных с подкожно (п/к) трансплантированной опухолью LLC1 (из коллекции опухолевых штаммов ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н. Н. Блохина»; Россия). Выбор данного штамма был обусловлен данными о равномерном распределении в опухоли рецептора αvβ3, который является RGD-связывающим интегрином [29]. Мышей-самцов С57Bl/6 весом 19–21 г группировали по 6 особей на каждую группу животных. Суспензию опухолевых клеток (4 000 000 кл./ мышь) вводили под кожу правого бедра. На 10-й день после трансплантации LLC1 вводили внутривенно по 0,2 мл исследуемых соединений. Количество радиоактивности каждого вводимого соединения составляло 1,85 МБк на одно животное (92,5 МБк/кг). Для отбора образцов тканей животных декапитировали и проводили аутопсию с взятием артериальной крови. Аутопсию проводили через 1, 3, 6, 9, 12 и 24 ч после однократного введения. Дозы радиоактивности вводимых соединений измеряли на дозкалибраторе IZOMED 2010 (MED Nuklear-Medizintechnik Dresden GmbH; Германия). Распределение исследовали с помощью прямой радиометрии биологических образцов.

Уровень радиоактивности измеряли на сцинтилляционном автоматическом гамма-счетчике WIZARD 2480 (Perkin Elmer; США). Оценку результатов накопления осуществляли по содержанию ¹⁸⁸Re в 1 г ткани/органа в процентах от введенного количества.
Изучение терапевтической эффективности ¹⁸⁸RE-НК проводили на мышах-самцах линии С57Bl/6 весом 20–22 г. Мышей группировали по 8 особей. Через двое суток после п/к трансплантации LLС1 животным одноразово системно вводили по 0,2 мл ¹⁸⁸Re-перрената натрия и ¹⁸⁸RE-НК в 0,9%-м растворе NaCl. Были исследованы следующие дозы по активности ¹⁸⁸Re: 15 МБк/кг, 92,5 МБк/кг, 185 МБк/кг (0,3 МБк, 1,85 МБк, 3,7 МБк на животное). В контрольной группе вводили 0,2 мл 0,9%-го NaCl. В течение всего эксперимента ежедневно измеряли размеры опухолей и их объемы. По полученным данным в группах контроля и эксперимента рассчитывали стандартный количественный показатель противоопухолевого действия T/С по формуле [30]:

Т/С = 100 • V_опыт / V_контр,

где V_опыт — средний объем опухолей у животных в экспериментальной группе, V_контр — средний объем опухолей у животных в контрольной группе.

Для анализа данных использовали программы OriginPro 8.0 (OriginLab; США) и Excel 2003 (Microsoft; США). Статистическую значимость полученных результатов определяли при помощи непараметрического U-критерия Манна–Уитни, а различия считали статистически значимыми при р ≤ 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Критериями оценки наличия острой токсичности соединения служили число павших животных и сроки их гибели с момента введения дендримера. Было установлено, что гибель животных начинается при введении дозы дендримера 500 мг/кг (2 из 6 животных), 4 из 6 животных погибают при дозе 1000 мг/кг и все животные в группе погибают при дозе 1500 мг/кг. При введении летальных доз дендримера мышам в течение первых 30 мин наблюдали транзиторное двигательное возбуждение, переходящее в сопорозное состояние. Смерть животных наступала в зависимости от дозы дендримера в течение 144 ч. У выживших мышей в течение первых 5 дней после введения соединения отмечали транзиторную потерю массы тела (5–8%) и проявление повышенной двигательной активности. При проведении некропсии животных было отмечено следующее: сердце, почки, селезенка и легкие — без визуально выраженной патологии; брюшина — без видимых изменений и гиперемии; печень — увеличена в размерах, края притуплены. При введении в сублетальных дозах соединение не вызывало видимых нарушений состояния и поведения животных: признаков атаксии или местных парезов не наблюдали. Мыши прибавляли в весе в соответствии с динамикой контрольной группы, состояние видимых кожных покровов не изменялось. При аутопсии выведенных из эксперимента животных видимых изменений внутренних органов не выявили. На основании данных о количестве павших животных в каждой из 10 экспериментальных групп были рассчитаны токсические дозы дендримера для мышей: ЛД10 = 270 ± 92 мг/кг; ЛД16 = 382 ± 94 мг/кг; ЛД50 = 779 ± 111 мг/кг; ЛД84 = 1177 ± 196 мг/кг; ЛД90 = 1289 ± 260 мг/кг; ЛД100 = 1376 ± 367 мг/кг.

Результаты распределения ¹⁸⁸RE-НК в сравнении с ¹⁸⁸Re-перренатом натрия в организме мышей с п/к трансплантированной LLC1 представлены в табл. 1. Статистически значимые различия были выявлены только при анализе данных о накоплении соединений в опухоли. Динамика накопления ¹⁸⁸Rе-НК и ¹⁸⁸Re-перрената натрия в образцах LLC1 представлена на рис. 2.

В связи с тем, что ¹⁸⁸Rе-НК разрабатывается для противоопухолевой радиотерапии, важной фармакокинетической характеристикой является дифференциальный уровень накопления данного соединения в опухоли. С этой целью были рассчитаны величины коэффициентов дифференциального накопления (КДН) — отношения удельной активности опухоли к удельной активности других органов и тканей (табл. 2). Почти для всех органов и тканей после 3 ч величина отношений для ¹⁸⁸Rе-НК выше 1, что свидетельствует о более интенсивном выведении соединения из органов по сравнению с опухолью. В то же время для ¹⁸⁸Re скорость выведения из опухоли была сопоставима с выведением из печени и костной ткани.

Терапевтическую эффективность определяли в течение месяца после трансплантации опухоли животным.
При однократном введении ¹⁸⁸Rе-НК выраженный противоопухолевый эффект (р < 0,05) на всех сроках наблюдения имел место только при введении дозы 185 МБк/кг (табл. 3, рис. 3 А). После введения животным ¹⁸⁸Re- перрената натрия в дозе 185 МБк/кг терапевтического эффекта не наблюдали (рис. 3 Б). Значения количественного параметра противоопухолевого эффекта Т/С для исследованных доз ¹⁸⁸Re представлены в табл. 3.
Наблюдаемый противоопухолевый эффект носил дозозависимый характер: в использованном диапазоне доз ¹⁸⁸Rе-НК при максимальной дозе, равной 185 МБк/ кг, наблюдали значимый противоопухолевый эффект; при промежуточной дозе, равной 92,5 МБк/кг, — слабовыраженный и при дозе 15 МБк/кг — незначительный. Представленные кривые роста опухолей наглядно иллюстрируют динамику описанных процессов. Таким образом, были определены минимально эффективные концентрации ¹⁸⁸Rе-НК для достижения терапевтического эффекта.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В результате проведенных исследований было установлено, что токсичность предложенного дендримера сопоставима с токсичностью аналогичных дендримеров данного класса, исследованных ранее [31].
Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что ¹⁸⁸Rе-НК, попадая в опухоль, удерживается тканями опухоли длительное время: до 6 ч после введения соединения. На протяжении 6 ч содержание ¹⁸⁸Rе-НК в опухоли остается достаточно высоким и составляет 8,2% от введенного количества. Это может свидетельствовать о прочном связывании ¹⁸⁸Rе-НК со структурами опухолевой ткани. При аналогичном анализе динамики накопления ¹⁸⁸Re-перрената натрия такого эффекта не наблюдалось. Максимальное соотношение активностей ¹⁸⁸Rе-НК и ¹⁸⁸Re-перрената натрия в опухолевых тканях составило 3,55 ± 0,660 через 6 ч после введения.
Полученный in vivo значимый противоопухолевый эффект при дозе ¹⁸⁸Rе-НК, равной 185 МБк/кг, с учетом коэффициентов межвидового пересчета составляет для человека 15,42 МБк/кг, тогда как типичные значения терапевтических доз, существующих РФП достигают 44–47 МБк/кг [32]. Это позволяет снизить лучевую нагрузку на пациента при сохранении терапевтической эффективности. Еще одно преимущество предлагаемой нами конструкции — ее низкая токсичность. В нашем исследовании для полного связывания ¹⁸⁸Re использовали 100-кратный избыток НК; доза НК при 185 МБк/кг составляет 4,05 • 10^-3 мг/кг (или 2,16 • 10^-3 мг/кг по дендримеру), что ниже ЛД10 на 5 порядков. В совокупности описанные эффекты позволяют рассматривать предложенную НК как перспективную для создания РФП.

ВЫВОДЫ

В результате проведенного исследования была показана принципиальная возможность применения конструкций на основе созданных дендримеров как средства направленной доставки противоопухолевого агента, определен минимальный порог терапевтической дозы ¹⁸⁸Re в полученном соединении и показано, что действие синтезированного дендримера носит дозозависимый характер. Исследование острой токсичности на мышах показало низкую токсичность конструкции ¹⁸⁸Rе-НК. Установлена низкая токсичность исследуемого соединения, позволяющая достигать значимого противоопухолевого эффекта при вводимых дозах намного меньше дозы ЛД10. Выявленные уровни накопления и время удержания ¹⁸⁸Rе-НК в опухолевой ткани дают основание предполагать возможность достижения высокой терапевтической дозы β-излучения в патологическом очаге при ее использовании. Введение ¹⁸⁸Re в составе ¹⁸⁸Re-НК в дозе 185 МБк/кг вызывает значимый противоопухолевый эффект в течение 18 дней после лечения.