Наночастицы (НЧ), в основе которых лежат молекулярные нанокристаллы фотосенсибилизаторов (ФС), являются многообещающими агентами для флуоресцентной диагностики (ФД) и фотодинамической терапии (ФДТ). Нанокристаллы фталоцианина алюминия (AlPc) обладают преимуществом над молекулярными ФС, используемыми в клиниках ввиду значительно более высокой селективности накопления наноразмерных материалов [1–4]. Более того, молекулы, из которых они состоят, способны флуоресцировать только в мономерной форме при взаимодействии с биологическими структурами, предоставляя таким образом достаточную для ФД эффективность детектирования [1, 2]. Тип взаимодействия, интенсивность, время жизни, а также спектр флуоресценции зависят от фенотипа взаимодействующих клеток. Интенсивность флуоресценции НЧ AlPc значительно выше в патологической ткани (воспаленной или злокачественной) по сравнению с нормальной [1, 2]. Более того, НЧ AlPc можно рассматривать как зонды для использования в тераностике, поскольку они обладают флуоресценцией и фотодианмичсекой активностью.

Исследования in vitro новых противоопухолевых агентов, особенно ФС, в первую очередь опираются на исследование фототоксичности с использованием выделенных клеточных линий. Общепринятые двумерные клеточные культуры (2D-культуры) имеют быстрый неограниченный рост и не позволяют моделировать сложность и гетерогенность in vivo опухолей. Очевидно, что in vivo опухоли растут в трехмерной (3D) структуре со специфичной организацией и архитектурой, которую клеточный 2D-монослой не способен воспроизвести [5–7]. Клеточные 3D-культуры считаются более аккуратной и воспроизводимой моделью для осуществления исследования лекарственных препаратов in vitro. Эта модель обладает рядом признаков, характерных опухолям in vivo, таким как наличие внеклеточного матрикса, межклеточного взаимодействия, гипоксии, глубокого проникновения препаратов и сопротивления [8–10]. Следовательно, сфероидная in vitro модель является промежуточными этапом между 2D-исследованием in vitro и исследованием на животных моделях [11–13].

Целью работы было разработать модель, основанную на многоклеточных 3D-сфероидах, для исследования накопления и распределения НЧ AlPc.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Многоклеточные сфероиды выращивали путем засевания 104 клеток HeLa в планшет с 96 колодцами, предварительно покрытыми 1%-й агарозой. Среду в культуре клеток сфероида меняли каждые 2–3 суток. По достижению 140 ± 20 мкм в диаметре после 7 дней сфероиды использовали в эксперименте. В качестве ФС использовали НЧ фталоцианина алюминия, или НЧ AlPc (d ~ 100 нм, c = 10 мкг/мл). Исследование флуоресценции AlPc после различного времени инкубации производили методами лазерной сканирующей конфокальной микроскопии. Для микроскопии сфероиды промывали дважды предварительно нагретым натрий-фосфатным буфером (PBS). Все изображения получали при помощи лазерного сканирующего микроскопа LSM- 710-NLO (Zeiss; Германия). Использовали объектив 20× с числовой апертурой (NA) = 1.4. ФС фталоцианин алюминия (НИОПИК; Россия) готовили для исследования сфероидной модели. Поликристаллический порошок AlPc добавляли в дистиллированную воду в концентрации 1 мг/мл. Полученную взвесь диспергировали в ультразвуковом гомогенизаторе SONOPLUS HD2070 (Bandelin; Германия) с насадкой KE76 (20 кГц, амплитуда 165 мкм) [2]. Используя многоугловой спектрометр динамического рассеяния света Photocor Complex (Photocor; Россия), определили что средний диаметр частиц в водном коллоиде составлял 100–150 нм. Коллоид AlPc (в концентрации 10 мкг/мл) добавляли в среду с моделью сфероида для моделирования условий взаимодействия клеток опухоли с НЧ ФС. Основным свойством НЧ AlPc является способность к фотоактивации. Базовый коллоид НЧ AlPc не люминесцировал при возбуждении в полосу поглощения (на длине волны 633 нм и при двухфотонном возбуждении на 780 нм), т. е. нанокристаллы ФС в свободной форме не проявляли фотоактивности. Таким образом, коллоид НЧ AlPc изначально не был фотоактивным и не проявлял флуоресцентных свойств. Однако при взаимодействии НЧ AlPc с клетками в результате процессов метаболизма, происходящих в клетках, НЧ становятся фотоактивными (λ_fl ~ 670 нм при возбуждении на λ_ex~ 633 нм и двухфотонном нелинейном возбуждении на 780 нм для более глубокого сканирования среза).

Эксперимент состоял из следующих этапов (рис. 1):

1) В начале эксперимента 10 сфероидов перенесли на чашку Петри. Коллоид НЧ AlPc добавили к 10 сфероидам в концентрации 10 мкг/мл. Инкубировали ФС при 37 °C в течение 15 мин в темноте.

2) В течение последующей инкубации автофлуоресценцию возбуждали лазером 488 нм, одновременно с этим флуоресценцию НЧ AlPc возбуждали лазером 633 нм в сканирующем лазерном микроскопе. Флуоресцентный сигнал переставал расти после 1 ч инкубации с НЧ.

3) После этого сфероиды промывали дважды с PBS и рассматривали в флуоресцентном микроскопе. Флуоресцентные изображения получали с поверхности сфероида с использованием 20× объектива. После инкубации НЧ ФС фотоактивность НЧ была достаточной для ФД и ФДТ. Исходя из этого, обнаруженные зоны интереса облучали лазером с длиной волны 780/390 нм (двухфотонное возбуждение) после анализа накопления ФС.

4) Лазерное возбуждение проводили на длине волны 780/390 нм (двухфотонное возбуждение). Продолжительность лазерного воздействия адаптировали для каждого сеанса облучения. Оценку фотодинамического эффекта осуществляли путем окрашивания акридином оранжевым (AO) для определения здоровых клеток (MolecularProbes®; США) и бромистым этидием (EB) для определения мертвых клеток (MolecularProbes®; США). Сфероиды в PBS, предварительно отмытые от клеточной среды, для окрашивания инкубировали в растворе красителей в течение 5 мин. Окрашенные сфероиды из планшета с 96 лунками для in vitro культур переносили на чашки Петри (толщина стекла 0,17 мм) с раствором PBS. Распределение флуоресцентного сигнала AO/EB исследовали методами конфокальной микроскопии. Возбуждение флуоресценции AO производили лазером на длине волны 488 нм, его же флуоресценцию регистрировали в диапазоне длин волн 495–545 нм. Возбуждение флуоресценции EB производили лазером на длине волны 561 нм, его же флуоресценцию регистрировали в диапазоне 580–690 нм. В результате получили флуоресцентные изображения AO (зеленый) и EB (красный) в режиме проходящего света. Этот пошаговый подход позволил моделировать условия взаимодействия клеток опухоли с НЧ ФС в первый час и процессы ФД и ФДТ с НЧ AlPc in vivo.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Захват НЧ AlPc оценивали в течение 1 ч. Значительное накопление наблюдали первые 30 мин (рис. 2 А–В). После 40 мин инкубации флуоресцентный сигнал достиг плато без значительного дальнейшего изменения (рис. 2 Г–Е).

Усиление флуоресценции НЧ AlPc в пространстве и времени позволило отслеживать распределение ФС. Первые 15 мин аккумуляцию НЧ AlPc можно было наблюдать в периферических регионах. Именно периферические клетки имели доступ к НЧ и в первую очередь принимали участие в эндоцитозе. Только после 15 мин инкубации начали образовываться первые участки захвата НЧ. С течением времени они быстро неупорядоченно росли в центр сфероида (рис. 2 В, Г). Непотревоженный участок при этом уменьшился до одной области с минимальным захватом НЧ в центре (рис. 2 Д). Временная и пространственная динамика захвата НЧ AlPc, описанная выше, может быть объяснена гетерогенностью клеток в 3D-модели по метаболическим процессам и фенотипам. Иначе, захват НЧ AlPc наблюдался бы как однородный на периферии с небольшим концентрическим спадом в сторону центра сфероида.

Численная оценка захвата ФС в различных участках была получена за счет записи спектров флуоресценции (рис. 3). Перед началом анализа стоит ввести величину, называемую эквивалентным диаметром, которая в условиях неидеальной сферичности определяется как диаметр круга в 150 мкм (средний диаметр сфероида). Работу вели, предполагая, что площадь сфероида имеет то же значение, что и площадь поперечного сечения сфероида. Таким образом, полный флуоресцентный сигнал с участка был оцифрован и определены вклады от автофлуоресценции и флуоресценции НЧ AlPc (рис. 3 А, Б).

Сигнал автофлуоресценции измеряли в диапазоне 430–630 нм при возбуждении лазерным излучением с длиной волны 488 нм. Максимум флуоресценции НЧ AlPc имеет длину волны 670 нм при возбуждении лазерным излучением с длиной волны 633 нм (рис. 3). Анализ спектров от концентрических участков среза показал, что захват НЧ AlPc уменьшается с ростом автофлуоресценции от периферии к центру сфероида (рис. 3 Г).

Распределение захвата НЧ ФС с учетом только флуоресцентного сигнала было представлено в виде четырех сечений для удобного восприятия (рис. 4), что также демонстрирует максимум захвата ФС на периферии с локальным минимумом в центре.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Оценка способности к проникновению вглубь сфероида и фототоксичность НЧ AlPc были проверены методом конфокальной лазерной микроскопии. Полученное разнообразие захвата НЧ в различных участках сфероида свидетельствует о гетерогенности сфероидной модели по фенотипу клеток. Это предположение подтверждается разницей в фототоксическом эффекте в различных участках сфероида, обусловленной наличием кислорода. С этой точки зрения, данная модель для исследования захвата и фотоиндуцированной токсичности НЧ AlPc очень схожа с опухолями in vivo [14–15]. Такой результат можно объяснить различием в метаболических процессах в клетках. Действительно, согласно предыдущим исследованиям, апоптотическое ядро начинает формироваться в сфероидах диаметром приблизительно 150–200 мкм [16]. Аналогично опухолям in vivo многоклеточные сфероиды включают гипоксическую и апоптотическую/некротическую области, возникающие как результат формирования кислородного и питательного градиентов. Стоит заметить, что в сфероидах гипоксия возникает постепенно по мере роста сфероида [17]. Таким образом, наличие градиента захвата НЧ AlPc может быть объяснено существованием градиента питательных вешеств и различий в фенотипе в клетках 3D-модели. Степень доступности молекулярного кислорода в различных участках можно оценить по скорости спада флуоресцентного сигнала во время фотодинамического облучения с тем условием, что фототоксичность зависит только от наличия молекулярного кислорода. Фотовоздействие приводит к переносу энергии в результате тушения флуоресценции ФС, а также провоцирует производство активных форм кислорода, приводящих к гибели клеток. Участки со значительным фотодинамическим эффектом были определены путем сравнения флуоресценции НЧ AlPc до и после сеанса ФДТ. Анализируя участки сфероида, можно заметить, что остаточный сигнал флуоресценции ФС наблюдался только в центре, в то время как в остальных областях он отсутствовал (рис. 5). Это может быть связано с гетерогенной структурой сфероида, с различной доступностью глубоких участков для облучающего света и с различной пролиферативной активностью клеток. В частности, отсутствие молекулярного кислорода в центральной области сфероида может приводить к ограниченному фотодинамическому воздействию с частичным спадом флуоресценции. Таким образом, градиент кислорода в сфероидах может быть косвенно оценен в ходе анализа эффектов фототоксичности ФС. Он также лежит в основе свойств опухолей in vivo, таких как гипоксия.

Фототоксичность была оценена по жизнеспособности клеток сфероидов после окрашивания и выявления живых и мертвых клеток. Это было продемонстрировано в сравнении с окраской первичных сфероидов и выявлением живых клеток (рис. 6 А). Живые клетки были обнаружены после ФДТ только в центре сфероида (рис. 6 Б), мертвые клетки занимали основной объем (рис. 6 Б). Окрашивание, характеризующее жизнеспособность клеток, равномерно по всему объему 3D-модели, поскольку не учитывает метаболических процессов, происходящих в клетках в различных слоях сфероида.

Высокое накопление ФС и глубина проникновения являются самыми важными характеристиками для оценки противоопухолевой эффективности препарата. Эти характеристики нужно учитывать при исследовании новых ФС. Более того, основной причиной неполного уничтожения опухоли служит неоднородное распределение ФС. Поэтому особенно важно комплексное исследование пространственного и временного процесса распределения ФС в тканях. Сфероидные модели позволяют моделировать проникновение и внутриопухолевый транспорт НЧ ФС. На сегодняшний день было исследовано большое количество НЧ для эффективной и целевой доставки ФС. Недостатком некоторых наноносителей является ограниченное проникновение, но можно предположить, что размер НЧ тоже имеет большое значение [18–19]. Таким образом, можно заключить, что НЧ AlPc являются многообещающими ФС с высокой фототоксичностью, которые позволяют косвенно оценить распределения кислорода в тканях, клеточный фенотип и проводить анализ метаболических процессов в клетках. В то же время по оценке флуоресценции AlPc видно, что многоклеточные 3D-модели обладают такими характерными признаками опухолей in vivo, как межклеточное взаимодействие, гипоксия, градиент кислорода и градиент питательных веществ. Мы предполагаем, что сфероидная модель in vitro является хорошей платформой для исследования наноразмерных лекарств, включая ФС, до испытаний на животных моделях, в которых необходимо учитывать также иммунный ответ [20–24].

ВЫВОДЫ

В работе продемонстрировано преимущество использования НЧ AlPc в качестве ФС и многофункционального флуоресцентного зонда. НЧ AlPc имеют достаточную способность накапливаться, распределяться и проникать в сфероиды. С помощью микроскопических методик показано, что, несмотря на достаточное накопление, фотодинамическая активность НЧ AlPc зависит от биоокружения. В особенности НЧ AlPc позволили оценить гетерогенность опухолевой модели и косвенно определить концентрацию кислорода, фенотип клеток, составляющих 3D-модель, а также метаболические процессы в клетках. Это одни из самых важных параметров для специфической местной нанофототераностики. Полученные результаты могут быть полезны для исследования других клеточных моделей, например ко-культурных сфероидов, которые учитывают также иммунный ответ.