Первая вспышка болезни, вызванной вирусом Эбола (БВВЭ), была зафиксирована в 1976 г. в Ямбуку (Демократическая Республика Конго, в то время — Заир) и в Нзаре (Судан). В том же году от больного, проживавшего в долине реки Эбола, был впервые выделен возбудитель БВВЭ — вирус Эбола (Ebolaviruses), относящийся к семейству Филовирусов (Filoviridae) [1]. В настоящее время известно шесть видов вируса Эбола: Bundibugyo ebolavirus (BDBV), Zaire ebolavirus (ZEBOV), Reston ebolavirus (RESTV), Sudan ebolavirus (SUDV), Tai forest ebolavirus (TAFV), Bombali ebolavirus (BOMV), из которых наиболее патогенны для человека ZEBOV, SUDV и BDBV [2–3]. С момента первой вспышки в 1976 г. было зарегистрировано более 20 случаев БВВЭ, вызванных видами ZEBOV, SUDV и BDBV; самая крупная вспышка 2014–2016 гг. в Западной Африке переросла в эпидемию и унесла жизни более 12 000 человек. Наибольшее количество зафиксированных случаев БВВЭ было связано с заражением ZEBOV (табл. 1) [4].

ZEBOV, SUDV и BDBV патогенны для человека, вызывают острые вирусные высоконтагиозные лихорадки у людей и приматов. RESTV не вызывает заболевания у человека, однако у людей, работающих с обезьянами, зараженными RESTV, в сыворотке крови детектируют специфичные антитела к RESTV [4]. Причины, лежащие в основе столь разной патогенности между RESTV и патогенных видов вируса Эбола, пока остаются неизученными.
Масштаб эпидемии 2014–2016 гг. заставил мировое сообщество значительно интенсифицировать разработки вакцинных препаратов против БВВЭ. В настоящее время насчитывается более 10 вакцинных препаратов, четыре из них зарегистрированы для клинического применения [5]. Разработанные кандидатные и зарегистрированные вакцинные препараты обеспечивают 100%-ю защиту приматов от БВВЭ, вызываемой ZEBOV, их эффективность в отношении других видов вируса Эбола варьирует. Так как виды SUDV и BDBV тоже могут служить причиной вспышек и эпидемий БВВЭ, и вследствие выявления новых штаммов ZEBOV, необходима разработка вакцины/ вакцин, способных обеспечить защиту от всех известных патогенных для человека видов вируса Эбола.

Структура вируса Эбола

Вирионы вируса Эбола представлены нитями различной формы, состоят из оболочки, нуклеокапсида, полимеразного комплекса и матрикса [6] (рис. 1). В центре вириона находится нуклеокапсид, состоящий из оцРНК, связанной с белками NP, VP35, VP30 и L. Снаружи вирус Эбола покрыт липидной оболочкой, на поверхности которой расположены шипоподобные структуры, образованные гликопротеином GP.
В пространстве между оболочкой и нуклеокапсидом находятся белки VP40 и VP24, формирующие белковый матрикс [6].
Вирусный геном представлен оцРНК отрицательной полярности (рис. 2) [6], содержит семь генов, кодирующих девять белков: нуклеопротеин (NP), кофактор вирусной полимеразы (VP35), основной белок матрикса (VP40), три гликопротеина (секретируемый sGP, полноразмерный GP и малый секретируемый ssGP), минорный нуклеопротеин (VP30), мембраноассоциированный белок (VP24), вирусную полимеразу (L) [6–7].
Гликопротеин GP вируса Эбола — единственный белок, расположенный на поверхности вириона. Он играет ключевую роль на начальных этапах инфекционного процесса: связывании вириона с клеткой и последующей интернализации [7].

Особенности синтеза и процессинга гликопротеина вируса Эбола

Ген гликопротеина вируса Эбола кодирует три белковых продукта pre-sGP, pre-ssGP (оба предшественники секретируемых неструктурных гликопротеинов) и pre-GP (предшественник структурного трансмембранного гликопротеина). Нуклеотидная последовательность гена гликопротеина содержит семь последовательных урацилов в позициях 880–886, где образуется шпилька; шпилька является сложным участком для вирусной L-полимеразы [7–8], что приводит к редактированию РНК. В результате образуется три транскрипта:

– транскрипт, содержащий семь урацилов (~71%), кодирует sGP (364 а.о.);
– транскрипт, содержащий восемь урацилов (~25%), кодирует GP (676 а.о.);
– транскрипт, содержащий девять урацилов (~4%), кодирует ssGP (298 а.о.).

Первые 295 а.о. у гликопротеинов GP, sGP и ssGP одинаковые, однако все белки имеют разную С-концевую часть, что сказывается на их функциях. После синтеза pre-sGP подвергается процессингу клеточными протеазами, что приводит к образованию секретируемого sGP. Последний снижает эффективность гуморального ответа, оттитровывая на себя антитела, и Δ-пептида, который формирует поры в клеточной мембране (рис. 2) [8–9].
Рre-GP также подвергается процессингу клеточными протеазами, что приводит к образованию двух субъединиц: GP1 и GP2. Субъединицы формируют тримеризующиеся гетеродимеры, образующие шипы на поверхности вируса. GP1 содержит рецепторсвязывающий домен, гликановый кэп и муцинподобный домен для взаимодействия с рецепторами на поверхности клетки; GP2 — трансмембранный домен, заякоривающий комплекс в мембране (рис. 2). При этом субъединица GP2 имеет сайт связывания протеазы TACE, и в случае протеолитического расщепления происходит отщепление гликопротеина от мембраны и образование четвертого варианта GP — «сброшенного» гликопротеина shed GP [8].
Зрелый поверхностный гликопротеин GP выполняет одну из самых важных функций в жизненном цикле вируса — взаимодействует с клеточными рецепторами, благодаря чему происходит интернализация: вирус захватывается клеткой путем эндоцитоза/макропиноцитоза, затем в эндосомах под действием фурина и катепсинов клетки происходит отщепление муцинподобного домена и гликанового кэпа гликопротеина, в результате укороченный GP связывается с транспортером холестерина Ниманна–Пика (NCP1), что инициирует слияние эндосомной и вирусной мембран и происходит интернализация нуклеокапсида вируса в цитоплазму [10–11].

Структурные и иммунологические особенности различных форм гликопротеина вируса Эбола

Все секреторные формы белка (sGP, ssGP и «сброшенный» GP) выполняют функции защиты вируса от вирусонейтрализующих реакций протективного иммунитета хозяина. Зараженные вирусом Эбола клетки, секретируя данные гликопротеины, направляют формирование гуморального ответа против ограниченного числа эпитопов [12–13]. При этом превосходящие по количеству sGP, ssGP и «сброшенный» GP оттитровывают на себя основную массу IgG, снижая вирусонейтрализующее действие гуморального иммунитета хозяина [14]. Такие гликопротеины (особенно sGP, ssGP) способствуют формированию антител, которые обладают слабым нейтрализующим потенциалом либо не обладают им вовсе, что приводит к развитию феномена антителозависимого усиления инфекции: такие антитела распознают вирус и взаимодействуют с Fc-рецепторами на фагоцитах, заставляя их интернализировать комплексы вирус– антитело с помощью FcγR-опосредованного фагоцитоза [15]. При этом необходимо отметить тот факт, что, несмотря на наличие в составе секретируемых форм GP сайтов связывания протективных антител, вакцинация редуцированными формами не позволяет сформировать протективный иммунитет у 100% животных. Для формирования полноценного протективного ответа, который позволял бы защищать всех иммунизированных животных от БВВЭ, необходимо наличие полноразмерного GP [16–18], по всей видимости, из-за того, что в структуре полноразмерного белка присутствуют дополнительные сайты нейтрализации и Т-клеточные эпитопы. На это указывают исследования, в которых было показано, что среди антител, выделенных от реконвалесцентов, протективным потенциалом, помимо антител, узнающих GP1 (гликановый кэп), обладают антитела, которые специфично связываются с надмембранной частью GP2 [18–21], а также исследование CD8+-клеток памяти у реконвалесцентов, позволившее выявить эпитопы гликопротеина, важные для формирования протективного Т-клеточного ответа — области рецепторсвязывающего домена и гликанового кэпа гликопротеина [22].
Поскольку формирование полноценного протективного ответа происходит в ответ именно на иммунизацию полноразмерным гликопротеином или экспрессирующими ген gp конструкциями, большинство разрабатываемых и уже зарегистрированных вакцин создается на основе именно гликопротеина GP [23–24].

Анализ перекрестного иммунитета у вакцинированных и перенесших БВВЭ

Идеальная вакцина против БВВЭ должна обеспечивать протективный ответ на инфицирование всеми патогенными для человека вирусами рода Эбола, в связи с этим крайне важно понимать возможность формирования иммунного ответа не только против гомологичных, но и против филогенетически удаленных видов. Анализ последних работ показывает, что иммунизация приматов вакциной на основе рекомбинантного вируса везикулярного стоматита (rVSV-ZEBOV), экспрессирующего гликопротеин GP вируса Эбола изолята 1995 г., приводит к формированию иммунитета против всех ZEBOV (изоляты 1976, 1995 и 2014 гг.) [25]. Об этом же свидетельствуют исследования сывороток реконвалесцентов, перенесших БВВЭ (ZEBOV). В этих исследованиях было показано наличие в сыворотках IgG, способных перекрестно реагировать с гликопротеинами гетерологичных видов (SUDV и BDBV) [26–27]. Исследование кросс-протективности на приматах показывает, что использование гликопротеина ZEBOV (в составе rVSV) позволяет защитить 100% животных от летальной инфекции, вызванной BDBV, при этом иммунизация животных rVSV, несущим гликопротеин SUDV, не обеспечивает защиты от ZEBOV и BDBV [28–30].

В результате исследований возникновения перекрестного иммунитета у животных выявлена одна закономерность: для видов ZEBOV и BDBV показана кросс-протективность поствакцинального иммунитета, в то время как между этими видами и SUDV она отсутствует.
Для объяснения разницы в способности гликопротеинов различных видов вируса Эбола формировать кросс- протективный иммунный ответ нами был проведен сравнительный анализ структуры белка GP. Для этого не только выравнивали аминокислотные последовательности между вирусами видов ZEBOV, SUDV и BDBV, но и картировали иммунодоминантные эпитопы (ИЭ), т. е. обладающие наибольшей антигенностью, гликопротеинов у 1548 изолятов вируса Эбола (10 последовательностей BDBV, 23 последовательностей SUDV и 1515 последовательностей ZEBOV), взятых из открытой базы данных [31].

Детальный анализ иммунодоминантных регионов, проведенный в программе T Cell Epitope Prediction Tools в режиме деиммунизации [32], позволил идентифицировать 22 ИЭ (табл. 2 и табл. 3). Наибольшее разнообразие было обнаружено в муциновом домене субъединицы GP1, наименьшее — в GP2. При попарном сравнении ИЭ гликопротеинов вирусов Эбола было выявлено, что гомология ИЭ гликопротеинов вирусов ZEBOV и BDBV составила 75,8%, в то время как гомология ИЭ гликопротеинов вирусов ZEBOV и SUDV, а также SUDV и BDBV составила 63,2% и 61,5% соответственно (табл. 2). Следует заметить, что гликопротеины разных изолятов вируса Эбола вида ZEBOV, выделенных в 1976, 1995, 2014 и 2018 гг., практически не отличаются друг от друга и имеют минорные различия в области гликанового кэпа и муцинового домена (табл. 3). Средняя гомология ИЭ составила 98,7–100%.

Полученные данные свидетельствуют о большей филогенетической близости видов ZEBOV и BDBV, по сравнению с SUDV, однако не объясняют разницу в индукции защитного иммунитета у животных, иммунизированных соответствующими вариантами гликопротеина GP. Для объяснения этих различий мы проанализировали места связывания антител, которые способны обеспечивать перекрестную защиту от летальной инфекции, вызванной разными видами вируса Эбола. Такие антитела специфичны не только к GP1, но и к областям, примыкающим к трансмембранному домену GP2 [19–21, 33]. В недавних работах было обнаружено, что антитела, обладающие протективной эффективностью, связываются не с линейными, а с конформационными эпитопами в гликопротеине [34–36]. Проведенное нами исследование последовательностей GP показало, что позиции ключевых аминокислот, необходимых для связывания с протективными антителами, весьма консервативны. Анализ мест связывания антител, обладающих протективным потенциалом, показал, что позиции ключевых аминокислот (замена которых полностью блокирует способность антител связываться с GP) в эпитопах ZEBOV полностью идентичны позициям аминокислот в эпитопах гликопротеина вируса Эбола вида BDBV, при этом гомология с этими аминокислотами в эпитопах гликопротеина вируса Эбола вида SUDV колеблется в пределах 30–60% (рис. 3). По нашему мнению, мутации в таких позициях аминокислот приводят к подавлению протективного действия антител. Гомология мест связывания протективных антител с гликопротеинами вируса Эбола различных видов, по-видимому, и обусловливает наличие кросс-протективного иммунного ответа между видами ZEBOV-BDBV и отсутствие кросс-протективного иммунного ответа между этими видами и SUDV.

Открытие универсальных антител, способных обеспечить протекцию от патогенных для человека видов вируса Эбола [:lit_19–21, 33–34, 36], служит предпосылкой к разработке не только эффективных средств терапии БВВЭ, вызванной различными видами вируса Эбола, но и рациональных подходов к созданию вакцины против этих патогенов. Исследования кросс-протективности, а также антител, полученных от реконвалесцентов после эпидемии БВВЭ, дают нам основания считать, что есть возможность создания вакцины на основе гликопротеина ZEBOV, которая могла бы обеспечивать протективный иммунный ответ против ZEBOV и BDBV. При этом для того, чтобы обеспечить протективный иммунитет к SUDV необходимо в состав вакцины включить гликопротеин SUDV.

ВЫВОДЫ

Сравнительный анализ структуры GP у 1548 изолятов, относящихся к ZEBOV, SUDV и BDBV, показал высокую вариабельность аминокислотных последовательностей GP вируса Эбола различных видов (~60–65% гомологии). Дальнейший анализ гомологии эпитопов GP ZEBOV, SUDV и BDBV, учитывающий третичную структуру белка, показал наличие общих аминокислот, связывание которых антителами позволяет нейтрализовать вирусы ZEBOV и BDBV, имеющие низкий процент гомологии в линейных аминокислотных последовательностях. Полученные результаты полностью согласуются с данными о способности существующих кандидатных и зарегистрированных вакцин индуцировать перекрестный протективный иммунитет в отношении вирусов ZEBOV и BDBV. При этом защиту всех иммунизированных животных от летальной инфекции, вызванной SUDV, обеспечивают только вакцины, сконструированные на основе антигена GP SUDV, но не GP других видов.
По нашему мнению, перечисленные факты свидетельствуют о том, что для создания эффективной вакцины, обеспечивающей защиту от известных патогенных видов вируса Эбола, необходимо использовать векторные конструкции, экпрессирующие как минимум два варианта гликопротеина — антигена GP вируса Эбола видов ZEBOV и SUDV.