Изучение окислительно-восстановительных (далее редокс-) процессов представляет собой актуальное и интенсивно развивающееся направление в современных биомедицинских исследованиях. Соотношение восстановленной (GSH) и окисленной (GSSG) форм глутатиона представляет собой один из важнейших показателей редокс-статуса клеток. Глутатион по своей природе — трипептид (γ-глутамилцистеинилглицин), концентрация которого в клетке может достигать высоких значений (до 10 мМ) [1]. Биологическая функция глутатиона обусловлена способностью его двух восстановленных молекул (2GSH) отдавать пару электронов молекуле акцептору. При этом глутатион переходит в окисленную форму с образованием дисульфида GSSG, который вновь может восстановиться с помощью фермента глутатионредуктазы (GR) [2]. GSH выполняет ключевую роль в реакциях восстановления перекисей липидов и пероксида водорода, которые возникают в клетках при окислительном стрессе. Структура и функции многих белков клетки зависят от обратимого формирования дисульфидных связей [3], восстановление которых происходит с помощью глутатиона. Таким образом, глутатион выполняет первостепенную роль в реакциях тиол-дисульфидного обмена клеток, а также вовлечен в глутатионилирование белков, что обусловливает его важную роль в процессах внутриклеточной редокс- сигнализации и фолдинга белков.

Многие патологические состояния вызваны нарушениями в системах, участвующих в регуляции внутриклеточного уровня глутатиона или его редокс-состояния (соотношения 2GSH/GSSG). Так, нарушение синтеза глутатиона, вызванное мутациями в генах, ответственных за синтез субъединиц γ-глутамилцистеинсинтетазы, связано с развитием ряда заболеваний: сахарного диабета [4], астмы [5], шизофрении [6] и др. Нарушения в работе глутатионредуктазы, поддерживающей пул глутатиона в восстановленном состоянии, ассоциированы, например, с системной красной волчанкой [7] и некоторыми формами фавизма [8]. В опухолевых клетках активность этого фермента часто наоборот оказывается повышенной, что приводит к увеличению концентрации GSH и усиливает антиоксидантную защиту патологических клеток [9]. Соотношение 2GSH/ GSSG служит важным показателем редокс-состояния внутриклеточной среды, изменение которого связано не только с патологией, но и с регуляцией многих физиологических процессов, например дифференцировкой [10, 11], пролиферацией [12], апоптозом [13]. Однако именно масштабные и неконтролируемые изменения клеточного тиол-дисульфидного обмена приводят к серьезным заболеваниям, в том числе нейродегенеративным, а также связанным с отклонениями работы многих систем органов, в том числе иммунной, сердечно-сосудистой и рядом других [14]. Существуют и другие функции глутатиона в организме. Известно, что метаболизм различных ксенобиотиков включает в себя стадию конъюгации с GSH в реакции, катализируемой глутатионтрансферазами [15].

Определить GSH и GSSG в образце можно с помощью метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Другой подход исследования редокс-состояния пула глутатиона в биологических образцах основан на использовании химических красителей. Таким классическим красителем является реагент Эллмана [16], использование которого подразумевает разрушение клеток для получения клеточных экстрактов или гомогенатов тканей. Синтетические красители ThiolQuant Green [17] и RealThiol [18] позволяют проводить измерения в целостных клетках. Однако с помощью обоих «прижизненных красителей» можно оценить количественные изменения только GSH. В настоящее время наиболее популярным инструментом для исследования динамики соотношения 2GSH/GSSG служит семейство генетически кодируемых индикаторов на основе редокс-чувствительных флуоресцентных белков (roFP). Функционирование таких индикаторов основано на окислении двух поверхностных остатков цистеина, введенных в структуру флуоресцентного белка методом точечного мутагенеза. Степень окисления редокс- чувствительных цистеиновых остатков биосенсора определяется окружающим пулом глутатиона. Остатки цистеина в структуре белка расположены близко друг к другу таким образом, что при окислении в ответ на изменение соотношения 2GSH/GSSG образуют дисульфидную связь. Образование такой связи в структуре белка приводит к конформационным изменениям, влияющим на его спектральные свойства. Таким образом, в зависимости от значения параметра 2GSH/GSSG roFP находится в окисленном или восстановленном состояниях, которые можно различить спектрально. Поскольку такой индикатор имеет белковую природу, его ген можно экспрессировать в исследуемой биологической системе любого уровня сложности: от отдельных клеточных органелл до тканей трансгенного организма. Первый представитель этого семейства индикаторов был создан на основе желтого флуоресцентного белка [19], позже появились белки на основе зеленого [20, 21]. К настоящему моменту создана обширная коллекция редокс-чувствительных индикаторов для мониторинга динамики изменения соотношения 2GSH/ GSSG в живых системах в режиме реального времени. Существующие версии отличаются по многим своим параметрам, например, по спектральным характеристикам, редокс-потенциалу, скорости реакции, специфичности [22].

Индикаторы с красной эмиссией флуоресценции наиболее удобны для работы in vivo из-за минимального поглощения света данного диапазона длин волн соединениями, которые содержатся в тканях (вода, гемоглобин, меланин и др.). Кроме того, зеленый свет, который используется для возбуждения хромофора красного белка, менее токсичен для клеток по сравнению с синим и фиолетовым, которыми возбуждают флуоресценцию индикаторов на основе белков с зеленой эмиссией. Целью настоящей работы было получение новой версии редокс-чувствительного индикатора на основе красного флуоресцентного белка mKate2 [23]. Созданный нами индикатор roKate для регистрации изменения соотношения 2GSH/GSSG характеризуется повышенной рН-стабильностью и высокой яркостью. Особенностью биосенсора roKate является его необратимый ответ в клетках млекопитающих после окисления, что позволяет использовать его в качестве индикатора, обладающего «памятью окисления» пула глутатиона.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Получение генетических конструкций

С помощью направленного мутагенеза мы вносили точечные мутации в структуру красного флуоресцентного белка mKate2. Реакционная проба для амплификации ДНК содержала термостабильную полимеразу Tersus с соответствующим буфером (Evrogen; Россия), эквимолярную смесь dNTP (по 200 мкМ), праймеры (10 мкМ) и матричную ДНК (100 нг). Программа ПЦР включала 22 цикла, каждый из которых включал стадию денатурации (95 °С, 30 с), отжига праймеров (60 °С, 45 с), элонгацию (72 °С, 90 с).
Для улучшения свойств отобранных конструкций проводили случайный мутагенез. Реакционная проба содержала термостабильную полимеразу Taq с соответствующим буфером (Evrogen; Россия), праймеры (10 мкМ), dATP (200 мкМ), dTTP (200 мкМ), dCTP (200 мкМ), dGTP (360 мкМ), MnSO₄ (640 мкМ), матричную ДНК (20 пг). Программа ПЦР включала 27 циклов, каждый из которых включал стадию денатурации (95 °С, 30 с), отжига праймеров (60 °С, 45 с), элонгацию (72 °С, 105 с). Ожидаемое количество мутаций — 4–5 на конструкцию [24]. Полученные версии были клонированы в плазмидные векторы pQe30 (для экспрессии в бактериальных клетках) и pC1 (для экспрессии в клетках млекопитающих).

Работа с бактериальной культурой клеток

В работе использовали клетки E. coli штамма XL 1-Blue. Клетки растили в жидкой среде LB или на твердой среде на чашках Петри (1,5% агар, приготовленный на LB). Среда содержала антибиотики: 100 мкг/мл ампициллин (в случае использования вектора pQe30) или 25 мкг/мл канамицин (в случае использования вектора pC1).
Для скрининга флуоресценции бактериальных клонов использовали флуоресцентный бинокуляр US SZX12 (Olympus; Япония). Отбирали наиболее яркие колонии, которые переносили на твердую среду. Для последующих измерений использовали спектрофлуориметр Varian Cary Eclipse (Agilent; США). Для этого биомассу бактерий суспендировали в 1 мл PBS буфера и регистрировали спектры эмиссии (λex = 585 нм) и возбуждения флуоресценции (λem = 624 нм). Для изменения редокс- статуса клеток к суспензии добавляли H₂O₂ до конечных концентраций 100 мкМ — 2 мМ. Полученные результаты обрабатывали в программе OriginPro 9.0 (OriginLab; США).

Получение препарата рекомбинантного белка

Для получения препарата рекомбинантного белка наращивали биомассу бактерий E. coli XL 1-Blue, экспрессирующих ген биосенсора. Для этого бактериальные клетки трансформировали плазмидой pQe30 roKate. Полученный в данной системе белок на C-конце содержит гистидиновый таг (His-tag). Полученные клоны бактерий помещали в среду LB c антибиотиком (ампициллин 100 мкг/мл), условия роста — 16 ч при комнатной температуре (перемешивание 200 об./мин). Полученную суспензию бактерий осаждали центрифугированием в течение 15 мин при 2000 g и температуре 4 °С. Лизис клеток проводили с помощью коммерческого набора B-PER™ Bacterial Protein Extraction Reagent (ThermoFisher; США). Далее пробы центрифугировали в течение 20 мин при 18 000 g и температуре 4 °С. Надосадочную жидкость наносили на колонку, содержащую смолу TALON (Clontech; США), связывающую His-tag. Элюцию белка с колонки осуществляли раствором PBS (pH 7,0), содержащим 250 мМ имидазола. Для очистки рекомбинантного белка от имидазола использовали гель-фильтрационные колонки с сефадексом G-50 (GE Healthcare Life Sciences; Англия). Для восстановления дисульфидной связи белка пробу инкубировали 30 мин в растворе PBS с 20 мМ дитиотреитола.

Тестирование биосенсора in vitro

Аликвоту очищенного белка добавляли к 1 мл раствора PBS (pH 7,0) до конечной концентрации 100 нМ в кювете для спектрофотометрии. Спектры эмиссии и возбуждения флуоресценции регистрировали с помощью спектрофлуориметра Varian Cary Eclipse (Agilent; США), параметры регистрации: λex = 585 нм, λem = 624 нм. К пробе добавляли GSSG или GSH в диапазоне концентраций 50 мкМ — 2 мМ, после чего регистрировали спектры.
Для определения редокс-потенциала биосенсора очищенный препарат белка титровали растворами глутатиона, в которых соотношение GSH/GSSG варьировало от 10 : 0 до 0 : 10. Для расчета редокс-потенциала использовали следующий подход. Определяли величину Y по формуле:

Y = (F_n–F_min)/(F_max–F_n),

где F_n — интенсивность флуоресценции в пробе с заданным соотношением GSH/ GSSG, F_min — интенсивность флуоресценции в пробе с 1 мМ GSSG, а F_max — в пробе с 1 мМ GSH. По полученным значениям строили график зависимости logY от log([GSSG]/ [GSH]). Находили соотношение GSSG/2GSH, при котором сигнал биосенсора изменялся на 50%, найденное значение обозначали, как величину А. Константу равновесия Keq определяли по формуле: 

logK_eq = log(F_max/F_min) – logA.

Рассчитывали редокс-потенциал (Е) по формуле:

E = E₀ – (RT/nF) • lnK_eq,

где E₀ — редокс-потенциал глутатиона (–240 мВ) при pH 7,0, R — газовая постоянная (8,314 Дж/моль • К), T — температура (К), n — число электронов, участвующих в обмене, F — константа Фарадея (96490 Дж/моль/В).
Для определения степени окисленности (OxD) пула глутатиона и roKate в пробе с определенным соотношением GSH : GSSG использовали следующие формулы:

OxD_GSH = 2[GSH]/(2[GSSG] + [GSH]),

OxD_roKate = [GSH]/([GSSG](K_eq + [GSH]/[GSSG])).

Квантовый выход биосенсора рассчитывали по формуле:

QY = ((Em_roKate • Abs_mKate2)/(Em_mKate2 • Abs_roKate)) • QY_mKate2,

где Em_roKate и Em_mKate2 — интенсивность флуоресценции биосенсора roKate и белка сравнения mKate2 в максимуме эмиссии при λ = 624 нм, Abs_roKate и Abs_mKate2 — поглощение биосенсора roKate и белка сравнения mKate2 при λ = 590 нм, QY_mKate2 — квантовый выход mKate2 (известная величина, равная 0,4).
Для оценки коэффициента молярной экстинкции (ξ) регистрировали спектр поглощения при λ = 590 нм для нативного белка roKate и для белка, денатурированного в 1 мМ NaOH. Исходя из допущения, что ξ денатурированного хромофора roKate равен ξ mKate2 (62500 М^–1 • см^–1), рассчитывали коэффициент молярной экстинкции нативного roKate по следующей формуле:

ξ_{нативного} = (Abs_{нативного} • ξ_денат.)/Abs_денат.

Для определения величины рКа биосенсора использовали ряд буферных растворов с заданным значением рН от 3,0 до 11,0 с шагом 0,5. Аликвоту белка добавляли в каждый из растворов до конечной концентрации 100 нМ и регистрировали спектр возбуждения флуоресценции, после чего строили график зависимости интенсивности от рН.

Культура клеток млекопитающих

В работе использовали клетки линии HeLa Kyoto, которые культивировали в среде DMEM с 10% FBS, 2мМ глутамина, 1% антибиотиков пенициллина и стрептомицина. Условия содержания — 37 °С, 5% CO₂.
Перед проведением трансфекции клетки культивировали на 35 мм чашках со стеклянным дном для микроскопии FluoroDishes (World Precision Instruments; США). Плазмидную ДНК смешивали с реагентом для трансфекции FuGene HD (Promega; США), следуя рекомендациям производителя. После добавления трансфекционного раствора в культуральную среду с клетками, флаконы с конечной смесью помещали в инкубатор. Микроскопию проводили на следующий день.

Флуоресцентная микроскопия

Для микроскопии клеток использовали флуоресцентный микроскоп DMI 6000 B (Leica; Германия), оборудованный pтутнoй лaмпoй 120W HXP (Osram; Германия) в качестве источника света, и CCD-кaмepoй CoolSNAP HQ (Photometrics; США). Для регистрации флуоресценции в диапазоне красной области света использовали фильтр TX2 (Excitation: BP560/40; Emission: BP645/75). Перед микроскопией клеточную среду DMEM заменяли раствором Хэнкса, содержащим 15 мМ Hepes. Микроскопию проводили в 1 мл среды при температуре 37 °C. В качестве неспецифического окислителя внутриклеточного пула глутатиона использовали пероксид водорода, который добавляли к клеткам в объеме 100 мкл до конечной концентрации 750 мкМ. В качестве восстановителя использовали дитиотреитол до конечной концентрации 2 мМ. Полученные серии изображений анализировали с помощью программы Leica Application Suite Advanced Fluorescense (Leica; Германия). Конечную обработку результатов проводили с помощью программ ImageJ (EMBL; Германия) и OriginPro 9.0 (OriginLab; США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Получение генетических конструкций

Для создания редокс-биосенсора, позволяющего регистрировать изменение соотношения 2GSH/GSSG, мы выбрали красный флуоресцентный белок mKate2, который отличается высокой яркостью, повышенной рН- стабильностью в физиологическом диапазоне изменений, а также мономерным состоянием [23]. В структуру белка mKate2 с помощью направленного мутагенеза мы ввели пару остатков цистеина (Cys) таким образом, чтобы при окислении они могли формировать дисульфидную связь. Нами было получено 10 версий белка, отличающихся позициями вставок Cys: 142/198, 142/196, 141/161, 144/196, 141/198, 141/161, 141/196, 107/118, 140/214, 200/214. Известно, что равновесие между редокс-активными остатками цистеинов созданных ранее биосенсоров rxYFP, roGFP и пулом глутатиона устанавливается достаточно медленно. Однако если локально возле этих белков увеличить концентрацию глутаредоксина (Grx), реакция протекает значительно быстрее. По этой причине для увеличения динамических характеристик биосенсоров, rxYFP и roGFP были на уровне гена связаны с человеческим Grx1 через полипептидный линкер [25, 26]. Все полученные нами пробы на основе белка mKate2 также содержали на N-конце человеческий Grx1, присоединенный с помощью линкера (Gly-Gly-Ser-Gly-Gly)₆. На рис. 1А представлена схема функционирования предполагаемого биосенсора.

roKate в бактериальной системе экспрессии

Полученные нами генетические конструкции мы экспрессировали в бактериальных клетках E. coli штамма XL1 Blue. Через сутки у выросших клонов мы анализировали наличие флуоресценции и оценивали яркость. Для определения функциональной активности каждой светящейся версии биосенсора мы регистрировали изменение спектров возбуждения флуоресценции в суспензии бактерий до и после добавления пероксида водорода (Н₂О₂) до конечной концентрации 1 мМ. Н₂О₂ является сильным окислителем, который, в избытке попадая в клетку, значительно изменяет редокс-состояние внутренней среды, в том числе редокс-состояние пула глутатиона, сдвигая равновесие в сторону образования GSSG. В качестве отрицательного контроля в этой системе мы использовали белок Grx1-mKate2, не содержащий редокс-активных Cys в хромофорном окружении флуоресцентного белка и поэтому не демонстрирующий спектральных изменений в ответ на окисление. Среди всех вариантов для дальнейшей работы мы отобрали лишь две конструкции с Cys в положениях 141/198 и 141/196. Другие мутантные формы белка были либо не флуоресцирующими, либо не реагировали на окисление.

Интенсивность флуоресценции отобранных мутантных форм в ответ на добавление Н₂О₂ изменялась менее чем на 10%. Для улучшения свойств белков мы провели цикл случайного мутагенеза с их генами. Данный метод подразумевает внесение в ген контролируемого количества случайных мутаций. С помощью такого подхода можно получить тысячи вариантов одного и того же белка, отличающихся несколькими аминокислотными заменами. При дальнейшем скрининге можно отобрать версии с оптимальными свойствами, поскольку даже единичная мутация может привести к значительным изменениям интересующих параметров белка. После проведения нескольких циклов случайного мутагенеза мы отбирали наиболее яркие клоны, которые в дальнейшем тестировали в условиях окислительного стресса. В результате была отобрана версия, которая, помимо редокс-активных Cys141 и Cys198, содержала две дополнительные мутации Lys12Glu и Asn21Asp в структуре флуоресцентного белка. Указанную мутантную форму белка назвали roKate. Амплитуда ответа roKate в бактериальных клетках при окислении составляет не менее 40% (падение интенсивности флуоресценции).

Определение характеристик roKate in vitro

Для более детального исследования свойств полученной версии биосенсора мы выделили белок roKate. Для белка характерен один пик в спектре возбуждения флуоресценции с максимумом 585 нм и один пик эмиссии с максимумом в области 624 нм (рис. 1Б). Поскольку для первоначального скрининга мы использовали высокие концентрации Н₂О₂, прежде всего мы проверили, может ли Н₂О₂ напрямую окислять редокс-активные Cys остатки белка. Для этого в пробу с белком (100 нМ) добавляли Н₂О₂ до конечной концентрации 1 мМ, спектр возбуждения флуоресценции такой пробы не изменялся (рис. 1В). Если к белку предварительно добавить восстановленный глутатион GSH (1 мМ), а после в ту же пробу внести 1 мМ Н₂О₂, интенсивность флуоресценции падает примерно на 40%, что обусловлено окислением GSH (рис. 1Г). Такой же ответ мы регистрировали при добавлении к белку заранее окисленного глутатиона GSSG (1 мМ) (рис. 1Д). При этом данная реакция обратима в условиях in vitro. При внесении в эту же пробу фермента глутатионредуктазы (GR) и NADPH интенсивность флуоресценции белка возвращается практически к исходному значению (рис. 1Д). Таким образом, изменение флуоресцентного сигнала белка опосредовано изменением редокс-статуса глутатиона.
Для определения редокс-потенциала roKate выделенный белок титровали растворами с содержанием GSH и GSSG в разных соотношениях (от 10 : 0 до 0 : 10). На рис. 2А представлена зависимость степени окисленности roKate от степени окисленности глутатиона. По полученным данным мы определили редокс-потенциал биосенсора, который составил –245 мВ.
Используя стандартный ряд буферных растворов с заданным значением рН, мы протестировали рН- чувствительность белка. Хромофор флуоресцентных белков может находиться в протонированном и депротонированном состояниях, благодаря аминокислотному остатку тирозина в его составе. Поэтому интенсивность флуоресценции зависит от значения рН. В экспериментальной системе важно учитывать, насколько изменяется флуоресцентный сигнал используемого биосенсора при изменениях рН в физиологическом диапазоне значений (6,0–8,0). Мы определили, что pKa биосенсора roKate составляет 6,5. При изменении рН от 6,0 до 8,0 интенсивность флуоресценции увеличивается примерно в 3 раза (рис. 2Б).
Мы также оценили коэффициент молярной экстинкции roKate и квантовый выход, которые составили 36400 М^–1 см^–1 и 0,3 соответственно.

roKate в эукариотической системе экспрессии

Ген roKate был перенесен в вектор pC1 для тестирования сенсора в клетках млекопитающих. В человеческих клетках линии HeLa Kyoto максимальная амплитуда ответа составила 55% при окислительном стрессе, вызванном добавлением в среду Н₂О₂ (максимальная концентрация 750 мкМ) (рис. 3 А и Б). Повторное внесение Н₂О₂ осуществляли с целью выяснить максимальное изменение сигнала при окислении. Подобные биосенсоры в живых клетках обычно восстанавливаются клеточными системами без внесения каких-либо восстановителей. Однако roKate не восстанавливался в цитоплазме клеток HeLa Kyoto даже после инкубации с различными восстановителями (дитиотреитол, β-меркаптоэтанол, трис(2-карбоксиэтил) фосфин). Конструкция без Grx1 на N-конце значительно уступает полноразмерному биосенсору в скорости реакции (рис. 3А). Данный факт свидетельствует в пользу того, что Grx1 выполняет ключевую роль в установлении равновесия между внутриклеточным пулом глутатиона и редокс-активными остатками цистеина сенсора. Версия без редокс-активных остатков Cys в структуре mKate2 в данной системе не продемонстрировала изменений флуоресцентного сигнала.
В эукариотической системе биосенсор roKate окисляется необратимо. Таким образом, roKate позволяет детектировать в клетках млекопитающих только динамику окисления пула глутатиона и не позволяет визуализировать его обратного восстановления.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Мы разработали генетически кодируемый флуоресцентный биосенсор для регистрации редокс-состояния пула глутатиона на базе красного флуоресцентного белка mKate2. Полученный нами биосенсор roKate отличается по свойствам и дизайну строения от ранее разработанного варианта rxRFP [27]. Индикатор rxRFP был создан на базе кругового пермутанта красного белка cpmApple. Круговые пермутанты флуоресцентных белков получают путем соединения на уровне гена исходных N- и C-концов полипептидным линкером и формирования новых в непосредственной близости с хромофором. Таким образом структура кругового пермутанта флуоресцентного белка становится более конформационно подвижной, что влияет на изменение спектральных характеристик. В структуре биосенсора rxRFP редокс-активные остатки цистеина расположены на N- и C-концах кругового пермутанта, при этом белок не сшит с Grx [27], т. е. для его уравновешивания с окружающим редокс-состоянием пула глутатиона используется эндогенный Grx. Кроме того, хромофор круговых пермутантов флуоресцентных белков более открыт для окружающей среды по сравнению с закрытыми структурами нативных белков. По этой причине, например, биосенсор rxRFP чувствителен к физиологическим колебаниям рН.
Еще одним представителем семейства биосенсоров на основе красных флуоресцентных белков для регистрации соотношения 2GSH/GSSG является Grx1- roCherry. Структура биосенсора Grx1-roCherry устроена по классическому принципу и состоит из белка mCherry, содержащего пару редокс-активных цистеинов, и соединенного через полипептидный линкер Grx1. Данный биосенсор отличается от roKate редокс-потенциалом (–311 мВ), а также способностью к обратному восстановлению в различных клетках млекопитающих [28].
Помимо того, что биосенсоры с красной флуоресценцией более удобны для работы с системами in vivo, они могут быть использованы в комбинации с зелеными индикаторами в режиме многопараметрической микроскопии. Данный подход более информативен, поскольку позволяет регистрировать сразу несколько параметров в пределах одной биологической системы или один и тот же параметр, например, в разных компартментах клетки [29].
По неустановленной причине окисленный сенсор roKate в клетках млекопитающих не восстанавливается, поэтому он может быть использован в качестве «сенсора-памяти», фиксирующего момент окисления в живых клетках или тканях. Это может быть удобно в моделях с наличием длительных временных интервалов между биологическими событиями и регистрацией флуоресцентного сигнала, например при длительной пробоподготовке. За время, которое в некоторых случаях требуется для подготовки проб к анализу, восстановительные системы клеток могут восстановить пул глутатиона и исказить результат исследования. Поскольку roKate в клетках млекопитающих окисляется необратимо, эффект окисления глутатиона, вызванный различными воздействиями, может быть таким образом зафиксирован. Кроме того, биосенсор roKate также можно использовать для регистрации динамики окисления внутриклеточного пула глутатиона в режиме реального времени.

ВЫВОДЫ

Мы разработали новый генетически кодируемый красный флуоресцентный биосенсор roKate для регистрации редокс-состояния пула глутатиона. Биосенсор roKate может быть использован для изучения редокс-процессов, связанных с изменением соотношения 2GSH/GSSG в клетках бактерий. В клетках млекопитающих roKate окисляется необратимо. Данное свойство позволяет использовать roKate в качестве «сенсора-памяти», помогающего фиксировать во времени окисление пула глутатиона.