Вирус Эпштейна–Барр (ВЭБ) относится к ДНК- содержащим вирусам, входящим в семейство Herpesviridae и вызывающим у человека различные заболевания — от респираторных до онкологических. Известно 8 типов герпесвирусов, поражающих человека. Вирус простого герпеса 1-го и 2-го типов, варицелла-зостер (тип 3), ВЭБ (тип 4) и цитомегаловирус (тип 5) широко распространены в человеческой популяции. Инфицирование герпесвирусами типов 6 и 7 и ассоциированным с саркомой Капоши вирусом типа 8 встречается реже. Каждый взрослый человек инфицирован хотя бы одним типом герпесвируса, что диагностируют по наличию специфических антител в сыворотке крови. Так, 80–95% людей — латентные носители ВЭБ и цитомегаловируса [1]. Латентная ВЭБ- инфекция ассоциирована с некоторыми онкологическими заболеваниями [1–3], рассеянным склерозом [4–5], системной красной волчанкой [6], отягощает течение вирусного иммунодефицита человека [7], провоцирует формирование аутоантител к ДНК и белкам человека [8–9]. Основные антигены ВЭБ — вирусный капсидный антиген, ранний антиген и ядерный антиген 1 (EBNA1) [10–11]. Белок EBNA1 необходим для латентной стадии персистенции вируса. Антитела G-класса вырабатываются против этого антигена каждый раз при реактивации вируса и отражают суммарную латентную вирусную нагрузку.

Инфицирование ВЭБ происходит контактным путем через поцелуи, общую посуду, предметы личной гигиены. Заражение воздушно-капельным путем также возможно, но встречается реже. Передача вируса может происходить от матери к ребенку во время вынашивания и родов, а также при грудном вскармливании. По данным различных исследований, у 50% детей в возрасте до 3 лет выявляют антитела к ВЭБ [12–13]. Передача осуществляется, по- видимому, через общую посуду и поцелуи.
Аллергия I типа характеризуется формированием гуморального IgE-опосредованного ответа на белки, входящие в состав безвредных микрочастиц — пыльцы, мертвых клещей домашней пыли, эпидермис домашних животных и др. [14–15]. Показано, что в коже и бронхиальном эпителии больных с аллергией имеются значительные отличия от здоровых барьерных тканей [16–17]. Целью данной работы была оценка гуморального ответа на ВЭБ у больных с аллергией на A. alternata и D. farinae.
Ранее нами был разработан метод анализа антител IgG₁ к ВЭБ и IgE к различным аллергенам с помощью количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР) [18–19]. Иммуно-ПЦР (иПЦР) является чувствительным методом, используемым для детекции антител в биологических жидкостях [20–21]. Среди преимуществ иПЦР — линейность дозовых кривых в широком диапазоне концентраций, что позволяет определять титры специфичных антител с помощью меньшего количества разведения сывороток [18–19].

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Сыворотки

В работе использовали сыворотки детей и взрослых с гиперчувствительностью к клещам домашней пыли и грибу Alternaria alternata. Все сыворотки получены из КПО ФГБНУ НИИ вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова (Москва, РФ) с информированного добровольного согласия участников и собраны за период с 2009 по 2017 г. Пациенты проходили аллергодиагностику с использованием коммерческих наборов RIDA (Германия). Критерии включения в исследование сывороток больных с аллергией: наличие в них IgE к A. alternata или КДП D. farinae по анализу RIDA с классом 3 и более (максимум 6). Критерии исключения: пациенты, прошедшие аллерген- специфическую иммунотерапию; наличие перекрестной аллергии на A. alternata или КДП D. farinae. Донорами считали людей разных возрастов, у которых не были выявлены IgE к пыльцевой, бытовой или грибной панелям аллергенов.

Материалы

Для иПЦР использовали планшеты c высокой сорбирующей способностью (Costar; США), стрипованные планшеты для qiPCR Top Yield strips (ThermoFisher Scientific; США), твин-20, готовый раствор 3,3'5,5'-тетраметилбензидина (Sigma; США), козью сыворотку (Bovogen Biologicals; Австралия), биотинилированные моноклональные антитела к человеческим IgG₁–IgG₄ и IgE (Southern Biotech; США), мышиные антитела к IgA₁, IgA₂ человека, конъюгат козьих антител против IgG мыши с биотином и конъюгат стрептавидина с пероксидазой хрена (BD Pharmigen; США), биотинилированный олигодезоксирибонуклеоид (ОДН) (Lumiprobe; Москва), стрептавидин (Sigma; США). В работе использовали рекомбинантные белки rEBNA1, Der f 2 и Alt a 1, полученные ранее в нашей лаборатории [18, 22–23]. Остальные реактивы — фирмы Fluka (Швейцария).

Постановка иПЦР

Раствор рекомбинантного антигена rEBNA1 (10 мкг/мл) в карбонат-бикарбонатном буфере (0,05 М, pH 9,6) вносили в лунки стрипованного планшета для иПЦР в объеме 50 мкл на лунку и инкубировали в течение ночи при 4 °C. По окончании инкубации лунки промывали трижды буфером TETBS (20 мМ Tris-HCl, 150 мМ NaCl, 0,1 мМ ЭДТА, 0,1% твин-20, pH 7,5). Образцы сывороток разбавляли в 10 раз буфером TETBS с 20%-й козьей сывороткой, делали пятикратные серии разведений и вносили в лунки планшета в объеме 25 мкл на лунку. Каждый образец вносили в трех повторах. В качестве отрицательного контроля использовали фетальную коровью сыворотку (FBS) в 6 повторах. Планшет инкубировали на шейкере в течение 30 мин при комнатной температуре. После инкубации с образцами сывороток планшет отмывали три раза буфером TETBS и вносили в его лунки раствор биотинилированных антител к человеческим иммуноглобулинам IgG₁–IgG₄ или мышиных антител к человеческим IgA₁, IgA₂ или IgM в TETBS с 20%-й козьей сывороткой (1 : 1000) в объеме 50 мкл на лунку. Планшеты инкубировали на шейкере в течение 30 мин при комнатной температуре и далее промывали три раза буфером TETBS. Для анализа IgA₁, IgA₂ или IgM планшеты далее инкубировали с конъюгатом козьих антител против IgG мыши с биотином. После отмывки в лунки планшетов вносили 50 мкл стрептавидина (1 мкг/мл), инкубировали 10 мин, отмывали и вносили 5 пМ раствора ОДН в буфере TETBS с 20%-й козьей сывороткой в объеме 50 мкл на лунку и инкубировали на шейкере в течение 10 мин при комнатной температуре. По окончании инкубации лунки планшета промывали 3 раза буфером TBS (20 мМ Tris-HCl, 150 мМ NaCl, pH 7,5). В лунки планшета вносили смесь для ПЦР в объеме 35 мкл на лунку, сверху вносили минеральное масло в объеме 30 мкл на лунку. ПЦР в реальном времени проводили на амплификаторе DTprime (ДНК-Технология; Россия) по следующему протоколу: начальная денатурация в течение 5 мин при 94 °C и далее 40 циклов: 15 с отжиг и элонгация при 60 °C, 5 с денатурация при 94 °C. На каждом цикле проводили измерение величины флуоресцентного сигнала от зонда при длине волны 520 нм. Результаты ПЦР анализировали с использованием программного обеспечения амплификатора. Для каждого образца вычисляли среднюю величину порогового цикла (Cq) и стандартное отклонение. Порог детекции рассчитывали как три стандартных отклонения для (Cq-), где (Cq-) — величина порогового цикла в отрицательных образцах. Титр сыворотки оценивали как максимальное разведение сыворотки, при котором соответствующий образец считали положительным.

Статистический анализ

Среднее и стандартное отклонения рассчитывали с помощью программного обеспечения Excel (Microsoft Office, 2003). Корреляцию между титрами IgG₁-антител и группами пациентов оценивали с помощью параметрического χ2- теста Пирсона и t-теста Стьюдента. Результат считали статистически значимым при значении p < 0,05 в двустороннем анализе.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Особенности иммуно-ПЦР

Все исследования проведены методом иПЦР (таблица). Cтадии 0–3 аналогичны стадиям метода ИФА: нанесение антигена на подложку (стадия 0), инкубация с сывороткой крови (стадия 1), инкубация с биотинилированными антителами против IgG1 человека (стадия 2), инкубация со стрептавидином (ПЦР) или комплексом стрептавидин — перокисидаза хрена (ИФА) (стадия 3). Стадия 3 в иПЦР разделена на две и включает инкубацию со стрептавидином, а затем дополнительную инкубацию с ОДН, что позволяет увеличить чувствительность иПЦР. На стадии 4 проводили ПЦР или добавляли субстрат для пероксидазы хрена.
Стадия детекции в ИФА с помощью субстрата не является стандартизированной и варьирует от дня постановки и времени остановки реакции блоком. При анализе иПЦР сокращается примерно на 1 ч время постановки реакции; достигается стандартное проведение анализа, не зависимое от оператора; увеличивается чувствительность за счет получения более линейных данных [18–19].

Характеристика IgE-ответа на аллергены

Для работы отобрали сыворотки больных с диагностированным с помощью коммерческой системы RIDA IgE-ответом на клещей Dermatophagoides farinae и гриб Alternaria alternata. Среди имеющейся коллекции сывороток отбирали образцы с классом выше 3. На рис. 1 представлено распределение больных по классам RIDA. В части образцов сывороток IgE-антитела не были выявлены ни к одному из 15 аллергенов трех групп (пыльцевая, бытовая и грибная). Такие сыворотки использовали в качестве донорских. Далее из имеющейся коллекции отобрали по 30 сывороток больных и доноров в возрасте 0–15 лет.

Характеристика общего гуморального ответа на ВЭБ

Для анализа профиля антител к ВЭБ у больных с респираторной аллергией на КДП и гриб A. alternata использовали пул 10 сывороток с классом 5–6, полученных от больных в возрасте 3–15 лет. В качестве контроля использовали пул сывороток 10 доноров такого же возраста. Титры антител в rEBNA1 падали в ряду IgM > IgG₁ > IgA₁ > IgA₂ > gG₂ (рис. 2) у доноров и в ряду IgM > IgA₁ > IgG₁ > IgA₂ > IgG₂ у больных. Титры IgG₃ и IgG₄ были низкими в обеих группах. Достоверные различия между больными и донорами наблюдали только по уровням IgG₁ и IgA₁. Отношение титров IgG₁ к IgA₁ для доноров и больных составило 9 и 0,4 соответственно, что показывает доминирование IgA ответа у больных с аллергией и IgG₁ — у здоровых доноров.

Анализ IgG1 ответа на ВЭБ

При вирусных инфекциях в основном вырабатываются антитела класса IgG₁. На рис. 3А представлено распределение титров IgG₁ к ВЭБ в сыворотках больных с аллергией (сыворотки с аллергией на КДП и/или A. alternata) и доноров в зависимости от возраста. Показано, что инфицирование возникает в раннем возрасте в обеих группах. У некоторых 4–6-летних детей в обеих группах выявлялись титры IgG₁ > 1000. Средний титр IgG₁ в группе пациентов в возрасте 3–10 лет у больных и доноров составил 330 и 1500 соответственно, в возрасте 11–20 лет — 720 и 490, что показывает тенденцию к более ранней инфицированности/реактивности доноров. Из-за значительного разброса данных достоверных различий между группами не было. Не было также различий по уровню антител к ВЭБ между больными аллергией на КДП, гриб A. alternata и донорами (рис. 3Б).
Анализ доли индивидов, не имеющих антител к ВЭБ, имеющих низкие (< 100), средние (100–1000) и высокие (>1000) титры IgG₁, показал, что в обеих группах 75% детей в возрасте 3–15 лет являются латентными носителями ВЭБ (рис. 4А); у 45% индивидов в обеих группах выявлялись антитела с низкими титрами. Различия наблюдались между группами по продукции антител с высокими титрами: 20% доноров имели титры антител больше 1000 (2000– 8000); у больных с аллергией таких детей было только 7% (рис. 4А), что показывает большую резистентность к инфекции при аллергии. При этом титры антител к ВЭБ в соответствующих группах были близкими (рис. 4Б).

Анализ IgА₁- и IgM-ответов на ВЭБ

Выше было показано, что у больных с аллергией незначительно, но достоверно повышены антитела класса А₁ (р = 0,03). Более детальный анализ показал, что основное различие наблюдается на ранней стадии инфицирования (рис. 5А). Средние титры IgA₁ к ВЭБ у больных и доноров в возрасте 3–10 лет составили 425 и 265, в возрасте 11–30 лет — 690 и 370 соответственно. В обеих группах наблюдали рост титров антител с возрастом (рис. 5А). Интересно, что по титрам IgA₁ к ВЭБ наблюдали разницу между больными с разным типом сенсибилизирующего аллергена. Титры IgA1 к ВЭБ были достоверно выше при аллергии на КДП (рис. 5Б), чем у больных с IgE к A. alternata и доноров.
Средние титры IgM к ВЭБ на порядок превышали титры иммуноглобулинов классов G и A в сыворотках как доноров, так и больных. Индивидуальные данные разбивали на низкие (< 5000) и высокие (> 15 000) титры (рис. 5В, Г). Доля высокотитровых по IgM индивидуумов в обеих группах составила 60%. В этой группе не наблюдали различий в изменении титров IgM в зависимости от возраста и среднего титра (рис. 5В). В группе с низкими титрами IgM у больных с аллергией антитела появлялись раньше, чем у доноров (рис. 5В) и средние титры были выше (рис. 5Г). Повышение титров IgM в этой группе наблюдали при аллергии как на КДП, так и на гриб A. alternata (рис. 5Г).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В процессе естественного инфицирования ВЭБ формируются антитела разных классов и субклассов. У человека имеются антитела классов M, A, G и E, включающие субклассы IgG₁–IgG₄ и IgA₁–IgA₂. Основной пул антител М-класса относится к врожденному иммунитету и их титры повышаются при первичном инфицировании; IgA обеспечивают защиту слизистых оболочек; IgE повышаются при паразитарных инфекциях и аллергии. В настоящее время считается, что IgA и IgE относятся к адаптивному иммунитету, поскольку для этого требуется переключение В-клеток с IgM на другие субклассы. Однако в последнее время ставится вопрос локального переключения В-клеток на синтез IgA- и IgE- антител без участия Т-клеток [23, 24], что соответствует функционированию врожденного иммунитета. Антитела А-класса обычно относят к ранним антигенам VCA и EA [25]. Антитела классов М и А к ранним антигенам служат маркерами реактивации вируса или вторичного заражения. Антитела А-класса к позднему антигену ВЭБ EBNA1 также выявляются и значительно повышаются, например, при раке носоглотки [26].
Полученные нами данные показывают, что у больных с аллергическими реакциями в более ранний срок и в более высоких титрах повышаются титры IgA₁- и IgM- антител. При этом титры IgA₂ были ниже, чем титры IgA₁ и не различались между группами (данные не показаны). При аллергической реакции наблюдается воспалительная реакция в слизистых оболочках, повышается продукция цитокинов и хемокинов [17, 24], что способствует активации В-клеток. В случае высокотитровых сывороток продукция IgM в группах доноров и больных была сравнимой, что показывает равную эффективность иммунного ответа при реактивации вирусом B-клеток, синтезирующих IgM.

Основным протективным звеном адаптивного гуморального ответа являются IgG. Переключение В-клеток на синтез IgG происходит только при формировании антиген-специфичного Т-зависимого ответа на ВЭБ. Известно, что при противовирусном ответе доминирует IgG1-ответ [27–28]. По литературным данным, при ответе на вирус гепатита В титры антител падают в ряду IgG₁ > IgG₄ > IgG₃ > IgG₂ [27], при ответе на ВЭБ IgG₁>> IgG₂, IgG₃, IgG₄ [28]. Полученные нами данные для доноров характерны для ответа на ВЭБ с доминированием IgG₁. Для больных с аллергией средний уровень IgG₁ был ниже, чем в группе доноров, и сравним с уровнем IgG₂ (p = 0,14). Статистический анализ данных показал, что достоверные различия между больными с аллергией и донорами по титрам IgG₁ возрастают с возрастом. Ранее противовирусный ответ у больных с аллергией не изучали. В целом, полученные данные позволяют предположить, что при респираторной аллергии можно наблюдать повышение количества IgA₁- и IgM-антител к ВЭБ, что снижает его проникновение через эпителиальные барьеры и уменьшает общую вирусную нагрузку.

ВЫВОДЫ

Аллергия характеризуется повышенной реактивностью эпителиальных барьеров, что вызвано взаимодействием IgE с аллергенами. Повышение реактивности врожденной системы иммунитета, по-видимому, приводит к повышению противовирусного ответа на вирус Эпштейна–Барр, повышению титров IgA₁ и IgM, снижению титров IgG₁, коррелирующих с латентной вирусной нагрузкой.