Дыхательные тесты являются одним из наиболее эффективных и безопасных методов оценки состояния внутренних органов человека. В конце XX в. для диагностики заболеваний желудочно-кишечного тракта в клиническую практику был введен уреазный дыхательный тест на основе использования мочевины, меченной стабильным изотопом ¹³С [1] или радиоактивным аналогом ¹⁴С [2], являющийся в настоящее время «золотым стандартом» в обнаружении бактерии Helicobacter pylori [3]. В присутствии этого патогена, обладающего высокой уреазной активностью, происходит гидролиз мочевины на изотопно-меченый СО₂ и аммиак, которые затем попадают в кровь и выводятся через легкие [4]. Диагностический потенциал дыхательных тестов реализуется на основе регистрации количества выдыхаемого пациентом СО₂ с мечеными изотопами углерода с помощью масс-спектрометрии или счетчика Гейгера–Мюллера [5]. В отсутствие Helicobacter pylori у обследуемого пациента описанная реакция не идет, и полученные значения содержания изотопно-меченого СО₂ в выдыхаемом воздухе не отличаются от контрольных.
Неинвазивные дыхательные тесты характеризуются высокой точностью, экономической доступностью, низкой трудоемкостью и безопасностью, как для самого пациента, так и для врача. Они позволяют определить целый ряд показателей, необходимых для выбора правильного лечения [6].
На сегодняшний день разработаны дыхательные тесты для определения чувствительности к инсулину на основе ¹³C-глюкозы [7],
¹³С-метацетина [8], ¹³С-галактозы и 13С-аминофеназона [9], а также для диагностики хронических заболеваний печени, таких как вирусные гепатиты В и С, цирроз, токсический и алкогольный гепатит, и др. ¹³C-октановая кислота находит применение при измерении скорости опорожнения желудка [10], (¹³С₃-карбонил)триоктаноин служит для диагностики недостаточной секреции ферментов поджелудочной железы [4].
Работы, проводимые по увеличению производства изотопов углерода и созданию специализированной и недорогой аппаратуры для измерения изотопного состава выдыхаемого воздуха, позволяют надеяться на скорое внедрение этой методики в повседневную клиническую практику.

В разработке дыхательного теста для диагностики функциональной активности гепатобилиарной системы в роли основных компонентов лекарственных форм используют линолевую и линоленовую кислоты — жирные кислоты, углеродная цепочка которых состоит из 18 атомов углерода. Данные кислоты являются ненасыщенными: первая из них имеет две двойные углерод–углеродные связи, а вторая — три таких связи [11].
Формообразующий компонент данных лекарственных форм разрабатываемых дыхательных тестов представлен пирофосфатом натрия. Его широко используют в отечественных и зарубежных радиофармацевтических препаратах. Так, в России его применяют в виде основного вещества радиофармпрепарата «Пирфотех, 99mТс», который разрешен к медицинскому применению приказом Министра здравоохранения РФ № 507 от 14 апреля 1985 г. (регистрационный № 85/507/13) [12]. Препарат эффективен для сцинтиграфии скелета, визуализации острого инфаркта миокарда и кровеносного русла сосудистой оболочки глаза, ангиокардиографии и др. [12, 13].
В патенте РФ № 2630691 «Способ синтеза линолевой и линоленовой кислот, меченных изотопами углерода ¹³С и ¹⁴С» [14] описан оригинальный способ синтеза изотопно-меченых жирных кислот, предназначенных к использованию в диагностических дыхательных тестах для выявления патологии гепатобилиарной системы. Необходимым этапом разработки лекарственных и диагностических средств для внутреннего введения являются исследования их безопасности. Целью настоящей работы было исследовать острую и субхроническую токсичность изотопно-меченых линолевой и линоленовой кислот.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Изучение острой токсичности линолевой и линоленовой кислот, меченных изотопом ¹³С в положении 1, выполнено в соответствии с «Методическими указаниями по изучению общетоксического действия фармакологических веществ» [15]. Исследование проводили на 95 мышах линии BALB/C (самцы и самки, масса тела 18–20 г) и 45 крысах линии Вистар (самцы и самки, масса тела 180–210 г).
Изучаемые ¹³С-меченые кислоты синтезировали, как описано в патенте РФ № 2630691 «Способ синтеза линолевой и линоленовой кислот, меченных изотопами углерода ¹³С и ¹⁴С» [14]. Структуру и чистоту полученных промежуточных и конечных продуктов контролировали спектроскопией ядерного магнитного резонанса на приборе АМ-300, 300 МГц (Bruker; Германия) и DRX-500, 500 МГц (Bruker; Германия). Масс-спектрометрический анализ выполняли на установке Finnigan MAT Model Incos 50 (70 эВ) (Finnigan MAT; Англия) с прямым вводом и масс-спектрометре высокого разрешения MicrOTOFII (BrukerDaltonics; Германия) (ESI).
Экспериментальных животных, участвовавших в эксперименте, содержали в клетках типа Т-3, в условиях, соответствующих действующим Санитарным правилам по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник. Животные получали в неограниченном количестве водопроводную питьевую воду. Для питья использовали поилки (500-мл стеклянные бутыли с конической пробкой из нержавеющей стали с отверстием в центре). Кормление проводили в фиксированное время и только специализированными брикетированными кормами, сбалансированными по аминокислотному составу, минеральным веществам и витаминам. В течение всего эксперимента фиксировали общее состояние и поведение животных (двигательную активность, динамику массы тела, аппетит и состояние шерстяного покрова).

При испытаниях острой токсичности образцы испытываемых соединений растворяли в оливковом масле и принудительно с помощью зонда однократно вводили свежеприготовленные растворы в желудок в следующем диапазоне доз: для крыс 100–500 мг, для мышей — 10–50 мг. Длительность наблюдения за животными с начала эксперимента составляла 3 суток. Для выявления результатов испытания острой токсичности исследуемых соединений при однократном внутрижелудочном способе введения мышам BALB/c и крысам Wistar определяли значения летальной дозы (ЛД50) по методу Дейхмана и Лебланка [15].
Изучение субхронической токсичности испытываемых соединений проводили в соответствии с «Методическими указаниями по изучению общетоксического действия фармакологических веществ» [15]. Исследование выполняли на 150 крысах линии Вистар с массой тела 180–200 г. Изучаемые соединения в виде свежеприготовленных растворов в указанных дозах вводили ежедневно внутрижелудочно в течение 2 недель. Животные были разделены на несколько групп по 30 животных в каждой (15 самцов и 15 самок): I группа — контроль (масляный растворитель без действующего вещества); II группа — ¹³С-линолевая кислота, доза 5 мг/кг (в 5 раз больше диагностической дозы для человека); III группа — ¹³С-линолевая кислота, доза 25 мг/кг (в 25 раз больше диагностической дозы для человека); IV группа — ¹³С-линоленовая кислота, доза 5 мг/кг (в 5 раз больше диагностической дозы для человека); V группа — ¹³С-линоленовая кислота, доза 25 мг/кг (в 25 раз больше диагностической дозы для человека).
Забор крови у крыс производили из хвостовой вены в объеме 2,0–2,5 мл перед началом субхронического эксперимента, через неделю после начала эксперимента и по окончании 2-недельного наблюдения. Гематологический анализ образцов крови проводили с помощью автоматического счетчика крови «ПИКОСКЕЛЬ ПС-4М» («Медикор-Электромедика»; Венгрия).
Определение биохимических показателей сыворотки крови (глюкозы, общего белка, креатинина, холестерина и общего билирубина), а также активности ферментов сыворотки (щелочной фосфатазы, аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы и лактатдегидрогеназы) проводили с помощью полуавтоматического биохимического анализатора FP 901 (Labsystems; Финляндия).

По окончании субхронического эксперимента на 14-й день проводили забой крыс для патоморфологического исследования внутренних органов и тканей животных. Животных вскрывали сразу же после забоя, чтобы исключить возможный автолиз тканей и клеток внутриклеточными ферментами. На каждое животное составляли полный патологоанатомический протокол вскрытия.
Образцы органов и тканей фиксировали в 10%-м нейтрализованном растворе формалина, после чего проводили обезвоживание, обезжиривание и проводку тканей с их заливкой вручную в парафин с воском. Гистологические срезы получали с помощью санного микротома МС-1 («Амбимед»; Россия), что позволило сделать серийные срезы. После депарафинирования срезы окрашивали гематоксилин-эозином, заключали в канадский бальзам под покровные стекла, и полученные таким образом гистологические препараты микроскопировали. Микроскопирование и микрофотосъемку проводили с помощью оптической системы, состоявшей из микроскопа Leica CM E (Leica Microsystems; Германия) и окуляр- камеры «Микромед DCM-510 SCOPE» («Наблюдательные приборы»; Россия) при увеличении ×40, ×100, ×200 и ×400 с документированием снимков в программе Future Win Joe (Future Optics; Китай), входящей в комплект поставки окуляр-камеры. Данные патоморфологического обследования крыс экспериментальных групп, которым вводили ¹³С-линолевую и ¹³С-линоленовую кислоты, сравнивали с данными обследования животных контрольной группы.
Проверку гипотезы об отсутствии статистически значимых различий между контрольной и каждой из экспериментальных групп проводили с помощью непараметрического критерия Манна–Уитни и точного критерия Фишера, реализованного в виде пакета программ Statistica 8.0 for Windows (Dell; США). Проводили расчет медианы признака, интерквартильных интервалов, минимального и максимального значений [16]. При обработке качественных показателей вычисляли размер выборочной доли в процентах и ошибку выборочной доли. В случае отклонения нулевой гипотезы и принятия альтернативной (р < 0,05) проводили попарное сравнение групп с использованием непараметрического критерия Манна–Уитни, применяя поправку Бонферони при оценке значения р.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование острой токсичности ¹³C-меченых линолевой и линоленовой кислот при однократном введении

При введении препаратов в желудок в максимально вводимых дозах для мышей — 2,632 мг/кг, для крыс — 2,564 мг/кг картины интоксикации указанных животных, а также симптомов раздражения желудочно-кишечного тракта не наблюдали. Не было отмечено также гибели мышей и крыс. Не установлено видовых и половых различий в чувствительности животных к токсическому действию изученных соединений.
Таким образом, при введении в желудок двум видам мелких лабораторных животных ¹³C-меченых линолевой и линоленовой кислот в дозах, превышающих диагностическую в 2500 раз, на протяжении 3 суток наблюдения не было обнаружено явлений интоксикации и гибели животных. В спецификации на ¹³C-меченую линолевую кислоту (Science Lab; США) указана ЛД50, равная 3,2 г/кг. Этот показатель получен при введении животным значительно большего количества жирной кислоты. Таким образом, можно сделать вывод о том, что при испытаниях острой токсичности различия между коммерчески доступным аналогом и испытуемыми соединениями, синтезированными по оригинальной методике, различий в токсичности не обнаружено.

Исследование субхронической токсичности ¹³C-меченых линолевой и линоленовой кислот на крысах

При ежедневном 2-недельном внутрижелудочном введении ¹³C-меченых линолевой и линоленовой кислот крысам в дозах 5 и 25 мг/кг не выявлено существенных изменений в поведении и внешнем виде животных. Они имели гладкий шерстный покров, охотно поедали корм, сохраняли обычную двигательную активность.
Результаты исследования массы тела крыс во всех экспериментальных группах, получавших исследуемые препараты, в течение всего эксперимента представлены в табл. 1 и табл. 2.
Отсутствовали значимые различия между группами контроля и экспериментальными группами во всех случаях, кроме групп самцов, получавших ¹³С-линоленовую кислоту в дозах 5 и 25 мг/кг. В этом случае привесы животных в экспериментальных группах оказались выше, чем в контроле, что свидетельствует о стимулирующем влиянии испытываемого соединения на рост животных. Негативного влияния соединений на рост и состояние животных не выявлено.
Результаты исследований гематологических показателей экспериментальных животных по сравнению с контролем представлены в табл. 3.
В условиях субхронического опыта при введении ¹³C-линолевой кислоты крысам в дозе 5 мг/кг достоверные, хотя и небольшие отличия (по 1-му порогу достоверности) были выявлены в группе самцов по гемоглобину, а в группе самок — по лейкоцитам и тромбоцитам. Однако после 14 суток наблюдения эти отличия исчезали, что может свидетельствовать о случайном характере наблюдаемых колебаний.
Напротив, при дозировке ¹³C-линолевой кислоты 25 мг/кг через неделю наблюдений различий между группами не наблюдалось, но через 14 суток эксперимента было выявлено существенное снижение содержания лейкоцитов в группе самок (3-й порог достоверности) и слабо выраженное снижение уровня тромбоцитов в группах самок и самцов (1-й порог достоверности). Несмотря на наличие различий между группами, абсолютные значения этих показателей оставались в пределах нормы, что позволяет сделать вывод о безопасности испытываемого соединения.
Сведения о результатах определения уровня общего белка в сыворотке крови представлены в табл. 4.
При дозировке испытываемого соединения, равной 5 мг/кг, уровень общего белка в группах самок через неделю эксперимента, самок и самцов после 2 недель эксперимента достоверно выше, чем в контроле. Такие же результаты выявлены для группы самок через неделю и группы самцов через 2 недели при дозировке 25 мг/кг. Это свидетельствует о стимуляции синтеза белка испытуемым соединением, что не может быть рассмотрено в качестве признака токсического действия ¹³C-линолевой кислоты.
Гепатотоксичность кандидатных лекарственных средств традиционно оценивают по возрастанию уровня активности аспартат- и аланинаминотрансфераз, щелочной фосфатазы, лактатдегидрогеназы в сыворотке крови, а также уровню общего билирубина (табл. 5).

Произошло небольшое снижение уровня печеночных ферментов в сыворотке крови на первой неделе эксперимента при дозировке испытываемого соединения 5 мг/кг, тогда как на второй неделе эксперимента это снижение становится достоверным во всех группах. В случае щелочной фосфатазы еще большее падение активности в крови наблюдали при дозировке испытываемого соединения 25 мг/кг, однако в случае аминотрансфераз, напротив, наблюдается восстановление показателей активности на второй неделе эксперимента, сниженное на первой неделе.
Введение испытываемого соединения в обеих дозировках достоверно снижает уровень общего билирубина в крови как на первой, так и на второй неделе эксперимента (кроме группы самцов на второй неделе). Это наблюдение показывает, что испытываемое соединение не только не обладает гепатотоксичностью, но и может быть рассмотрено в качестве гепатопротектора.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Изучение функциональной пригодности разрабатываемых дыхательных тестов на мелких лабораторных животных осложнено тем, что отбор образцов выдыхаемого воздуха в строго заданных объемах у этих животных технически сложен. Поэтому испытания клинической эффективности дыхательных тестов с применением разрабатываемых соединений планируется проводить непосредственно на больных по окончании развернутых токсикологических испытаний. Аналогичный прецедент имел место при разработке уреазного дыхательного теста для выявления H. pylori с помощью ¹⁴С-мочевины [2].
Исследования острой токсичности ¹³С-линолевой и ¹³С-линоленовой кислот при однократном внутрижелудочном способе введения мышам линии BALB/c и крысам линии Wistar в дозах, в 500–2500 раз превышающих диагностическую, не выявили признаков общей интоксикации, симптомов раздражения желудочно-кишечного тракта в обоих случаях. Полностью отсутствовали случаи гибели мышей и крыс.
Исследования субхронической токсичности при пероральном введении ¹³С-линолевой кислоты крысам линии Wistar обоего пола в дозах 5 и 25 мг/кг (5- и 25-кратные диагностические дозы) ежедневно в течение 2 недель также не показали явного влияния на общее состояние и поведение животных и их функционального состояния.
Более того, испытываемые соединения в указанных дозировках, превышающих терапевтические дозы, рекомендованные для человека, оказывали благотворное действие, что отражалось на уровне гематологических и биохимических показателей крови: происходило более или менее кратковременное снижение уровня лейкоцитов и тромбоцитов крови, не выходящее за пределы нормальных значений, а также снижение активности щелочной фосфатазы, аминотрансфераз, лактатдегидрогеназы и билирубина. Указанные эффекты имели дозовую зависимость, позволяя предположить, что в случае применения испытываемых соединений в терапевтических дозах отмеченные эффекты будут сведены к нулю. Аналогичные эффекты для немеченных изотопами линолевой и линоленовой кислот описаны в литературе [17].

ВЫВОДЫ

Синтезированные согласно способу, описанному в патенте РФ № 2630691 «Способ синтеза линолевой и линоленовой кислот, меченных изотопами углерода ¹³С и ¹⁴С», ¹³С-линолевая и ¹³С-линоленовая кислоты оказались безвредными для животных в дозах, планируемых для перорального введения, и могут быть рекомендованы к доклиническим и клиническим испытаниям.